不同處理對牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生早期生理生化的影響

王 政，楊大娟，何松林,2*，毛倉倉，孟新亞，賀 丹

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)，芍藥科芍藥屬木本花卉，又名富貴花、木芍藥、鼠谷花等，為我國傳統(tǒng)名花，也是著名觀賞與藥用植物[1]。其株型端莊，花色艷麗，具有較高的觀賞價值和藥用價值。傳統(tǒng)的牡丹繁殖方式存在育種周期長、繁殖系數(shù)低等問題，導(dǎo)致其種植和生產(chǎn)難以形成規(guī)模，無法滿足牡丹產(chǎn)業(yè)化及商業(yè)化生產(chǎn)需求；現(xiàn)代生物育種為縮短育種周期提供可能，但其離體快繁體系仍不完善，生根率低且質(zhì)量不高，通過體細(xì)胞胚誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株將有效解決這一難題[2-4]。雖已利用牡丹鳳丹白愈傷組織[5]、鳳丹白綠色子葉[6]間接誘導(dǎo)出球形胚及以紫斑牡丹合子胚[7]為外植體直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚并獲得少量再生植株，但牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生頻率仍然很低，畸形胚發(fā)生概率大，且同步化發(fā)生困難[8]。有研究表明，毒莠定(PIC)對胚性愈傷組織的形成具有一定的作用，PIC是一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，適當(dāng)濃度的PIC可誘導(dǎo)草莓葉柄和雄蕊、百子蓮產(chǎn)生胚性愈傷組織[9-10]。光照在體細(xì)胞胚發(fā)生中也具有較為重要的作用，長光周期可促進(jìn)孜然、栓皮櫟體細(xì)胞胚誘導(dǎo)及川滇高山櫟未成熟的合子胚體細(xì)胞胚形成[11-13]。目前研究表明，適宜濃度的PIC可以促進(jìn)牡丹體細(xì)胞胚誘導(dǎo)[3]，但不同光暗條件及PIC濃度對其體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中生理生化的影響尚未見報道。鑒于此，以牡丹品種鳳丹白鱗芽為材料，研究不同光暗處理和PIC濃度處理條件下牡丹體細(xì)胞胚早期發(fā)生時期及其誘導(dǎo)過程中內(nèi)源激素、可溶性蛋白含量及酶活性的動態(tài)變化，以期為體細(xì)胞胚發(fā)生機(jī)制相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 外植體選擇及處理 以牡丹鳳丹白(P.suffruticosa‘Fengdanbai’)未萌動的鱗芽為外植體(采自洛陽神州牡丹園苗木基地)，除去表面一層鱗片后，在自來水下沖洗30 min放在超凈工作臺上，進(jìn)行消毒滅菌。具體消毒方法為：75%乙醇消毒30 s，無菌水沖洗2 min (2次)，0.1% HgCl2消毒8 min，無菌水沖洗2 min(2次)，無菌水沖洗3 min(2次)。

1.1.2 愈傷組織的獲得 將消毒后的牡丹鱗芽剝?nèi)ネ獠亏[片，將芽接種到MS+Ca2+(WPM)+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮(PVP)1.0 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH=5.8)的固體培養(yǎng)基上，在常規(guī)培養(yǎng)條件，即溫度(24±1) ℃，光照時間12 h/d，光強(qiáng)40 μmol/(m2·s)下誘導(dǎo)培養(yǎng)40 d，獲得試管苗。將試管苗的葉柄轉(zhuǎn)入1/2MS+Ca2+(WPM)+6-BA 1.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH=5.8)的固體培養(yǎng)基上，在常規(guī)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)40 d，獲得愈傷組織。

1.1.3 愈傷組織增殖培養(yǎng) 將愈傷組織轉(zhuǎn)入1/2MS+Ca2+(WPM)+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L(pH=5.8)的固體培養(yǎng)基上，在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，作為供試材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 根據(jù)前期的研究結(jié)果，選定4.0 mg/L PIC為體細(xì)胞胚培養(yǎng)最適質(zhì)量濃度[14]，研究設(shè)置2個處理和2個對照：處理1 (光/暗12 h/12 h、PIC 4.0 mg/L)，處理2 (光/暗0 h/24 h、PIC 4.0 mg/L)，光CK (光/暗12 h/12 h、PIC 0 mg/L)，暗CK (光/暗0 h/24 h、PIC 0 mg/L)。處理1和處理2均以MS+6-BA 0.5 mg/L+PIC 4.0 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L (pH=5.8)為培養(yǎng)基，光CK和暗CK均以MS+6-BA 0.5 mg/L+PVP 1.0 g/L+LH 0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L (pH=5.8)為培養(yǎng)基，每個處理15瓶，每瓶接種3塊愈傷組織。

1.2.2 指標(biāo)測定 分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)時期的0、6、12、18、24、30、36 d測定相關(guān)指標(biāo)：吲哚乙酸(IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、可溶性蛋白含量，過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)的活性變化。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行內(nèi)源激素含量的測定，試劑盒購買于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)；采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[15]；采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定SOD活性[15]；采用KMnO4法測定CAT活性[15]；采用Nakano等[16]的方法測定APX活性；采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白含量[17]；采用石蠟切片[18-19]進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)均采取鄧肯氏新復(fù)極差測驗法檢測差異顯著性，Excel 2003及DPS 7.05軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果

如圖1所示，通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，處理1 (圖1A)和處理2 (圖1B)條件下的鳳丹白愈傷組織較大，但相比于處理1，處理2條件下的愈傷組織顏色較白；光CK (圖1C)條件下產(chǎn)生的愈傷組織較小，暗CK (圖1D)條件下的產(chǎn)生的愈傷組織最小且有些發(fā)黃。與沒有添加PIC的對照相比，添加PIC條件下(處理1和處理2)產(chǎn)生的愈傷組織較大。與暗培養(yǎng)條件下相比，處于光照12 h/d的條件下(處理1和光CK)產(chǎn)生的愈傷組織較綠。

如圖2所示，通過大量的石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，不同處理對牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生時間影響明顯。在處理1條件下，鳳丹白愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)的18 d開始形成少量胚性細(xì)胞(圖2A)，24 d有大量胚性細(xì)胞出現(xiàn)(圖2B)，在30 d出現(xiàn)球形胚(圖2C)，36 d形成大量的球形胚并伴有少量的心形胚(圖2D、E)；處理2條件下也形成了球形胚(圖2F)，但其時間相比于處理1晚6 d，而且數(shù)量很少；光CK和暗CK條件下則在36 d仍沒有出現(xiàn)球形胚。

A：處理1；B：處理2；C：光CK；D：暗CK圖1 不同培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)36 d鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生宏觀情況

A：18 d處理1下胚性細(xì)胞開始形成；B：24 d處理1下胚性細(xì)胞大量形成；C：30 d處理1下早期球形胚開始形成；D：36 d處理1下球形胚大量形成；E：36 d處理1下心形胚的形成；F：36 d處理2下球形胚的形成圖2 添加PIC后鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生微觀情況(100倍)

2.2 內(nèi)源激素含量的變化

2.2.1 IAA含量 如圖3所示，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，處理1和處理2的IAA含量整體呈先上升后下降的趨勢，并均于30 d出現(xiàn)峰值(365.31、325.52 ng/g)，處理1的IAA含量整體高于處理2 (12 d除外)。光CK與暗CK的IAA含量變化整體均呈現(xiàn)下降趨勢，且暗CK的IAA含量整體高于光CK (除24、36 d外)。同時發(fā)現(xiàn)有光、無光情況下添加PIC處理可顯著提高IAA含量，特別是在12～36 d處理1和處理2的IAA含量水平顯著高于光CK和暗CK，且處理1的IAA含量在18～30 d(胚性細(xì)胞形成期及球形胚形成期)顯著高于其他處理，說明光照對IAA含量的促進(jìn)作用不明顯。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同圖3 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中IAA含量變化

2.2.2 GA3含量 如圖4所示，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，處理1和處理2的GA3含量變化整體呈下降趨勢，均于36 d降到最小值，分別為2.81、6.25 ng/g。暗CK處理下GA3含量變化整體呈先下降后上升趨勢，在12 d降至最低值(10.81 ng/g)，隨后上升，并于36 d達(dá)到最大值(23.91 ng/g)。光CK處理下的GA3含量在0～18 d迅速下降至最低值(10.81 ng/g)后，于18～24 d又急速上升至最大值(17.15 ng/g)，之后逐漸下降。同時發(fā)現(xiàn)添加PIC處理可以顯著降低GA3含量，而暗培養(yǎng)條件下有利于GA3含量的升高，特別是在18～30 d(胚性細(xì)胞形成期及球形胚形成期)處理1和處理2的GA3含量水平均低于光CK和暗CK，并產(chǎn)生顯著差異，處理2的GA3含量水平高于處理1，暗CK的GA3含量水平高于光CK。

圖4 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中GA3含量變化

2.2.3 ABA含量 如圖5所示，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，處理1和處理2的ABA含量變化在6～30 d整體呈上升趨勢，且均于30 d達(dá)到最大值，分別為426.38、555.59 ng/g，之后開始下降。而光CK與暗CK的ABA含量變化整體呈先上升后下降的趨勢，均于0～12 d上升到最大值后迅速下降，且分別于24 d和30 d達(dá)到最小值后緩慢回升。處理1和處理2的ABA含量峰值顯著高于光CK與暗CK，且峰值時期推遲了18 d。同時發(fā)現(xiàn)添加PIC條件下在胚性愈傷組織形成前期ABA含量顯著低于對照，但在胚性愈傷組織形成后期ABA含量顯著升高，尤其在18～36 d(胚性細(xì)胞形成期及球形胚形成后期)處理1和處理2的整體趨勢高于光CK和暗CK。

圖5 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中ABA含量變化

2.2.4 內(nèi)源激素平衡 如圖6所示，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，處理1和處理2的ABA/IAA比值在18～36 d呈現(xiàn)上升的趨勢，且整體始終保持平穩(wěn)增長態(tài)勢，均于36 d出現(xiàn)最高值，其中處理2的變化幅度大于處理1；光CK與暗CK的ABA/IAA比值整體呈先上升后下降的趨勢，均于12 d達(dá)到最大值后迅速下降；添加PIC條件下在胚性愈傷組織形成前期低于對照，尤其在12～18 d處理1和處理2低于光CK和暗CK，但在胚性愈傷組織形成后期PIC可促進(jìn)ABA/IAA比值平穩(wěn)增長，而光CK和暗CK則迅速下降。

圖6 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中ABA/IAA比值變化

如圖7所示，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，處理1和處理2的ABA/GA3比值均逐漸上升，于18～36 d出現(xiàn)大幅度上升，且根據(jù)細(xì)胞學(xué)觀察可知處理1在18～24 d有大量胚性細(xì)胞出現(xiàn)，在30 d出現(xiàn)球形胚，36 d形成大量的球形胚并伴有少量的心形胚。光CK與暗CK的ABA/GA3比值整體呈先上升后下降趨勢，同時發(fā)現(xiàn)添加PIC處理可以顯著提高ABA/GA3比值，尤其在18～36 d處理1和處理2的ABA/GA3比值顯著高于光CK和暗CK。

圖7 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中ABA/GA3比值變化

2.3 可溶性蛋白含量的變化

如圖8所示，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中，處理1和處理2的蛋白質(zhì)含量整體呈先上升后下降趨勢，并分別于30 d和24 d達(dá)到最大值(3.96、2.15 mg/g)。光CK與暗CK的蛋白質(zhì)含量整體呈先下降后上升趨勢，并在18 d分別出現(xiàn)最小值(1.03、1.97 mg/g)，在36 d分別出現(xiàn)最大值(1.97、1.64 mg/g)。同時發(fā)現(xiàn)光照和添加PIC條件協(xié)同促進(jìn)蛋白質(zhì)含量的升高，特別在18～36 d處理1的蛋白質(zhì)含量始終顯著高于其他處理；在12～36 d光CK始終高于暗CK，說明光照能顯著促進(jìn)蛋白質(zhì)含量的升高。

圖8 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中可溶性蛋白含量變化

2.4 抗氧化酶活性的變化

2.4.1 POD活性 如圖9所示，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中，處理1和處理2的POD活性整體呈“上升—下降”的波動趨勢，最大值[226.41、205.70 U/(g·min)]均在30 d出現(xiàn)。光CK的POD活性整體呈“下降—上升—下降”的趨勢，并在12 d出現(xiàn)最小值[80.93 U/(g·min)]，30 d出現(xiàn)峰值[156.19 U/(g·min)]；暗CK的POD活性呈“上升—下降—上升”的趨勢，分別在12 d出現(xiàn)最大值[154.15 U/(g·min)]和18 d出現(xiàn)最小值[84.63 U/(g·min)]后開始緩慢上升。同時發(fā)現(xiàn)添加PIC處理可以顯著促進(jìn)POD活性的升高，尤其在18～36 d處理1和處理2的POD活性始終高于光CK和暗CK，且差異顯著。

圖9 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中POD活性變化

2.4.2 SOD活性 如圖10所示，在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中，處理1和處理2的SOD活性呈“上升—下降—上升”的趨勢，并分別在18 d和12 d出現(xiàn)峰值[168.78、176.50 U/(g·min)]，而分別在30 d和24 d降到最小值[65.91、64.20 U/(g·min)]。光CK的SOD活性呈“上升—下降—上升”的急劇變化趨勢，并分別在12 d和30 d出現(xiàn)峰值[150.24 U/(g·min)]和最小值[98.77 U/(g·min)]，暗CK的SOD活性變化相對平穩(wěn)，0～24 d緩慢上升且到24 d出現(xiàn)最大值[149.13 U/(g·min)]后開始緩慢下降。處理1的SOD活性峰值比光CK提高了9.49%，處理1的SOD活性谷值的出現(xiàn)比處理2推遲了6 d，且在18～36 d暗CK顯著高于光CK，說明光照條件下有助于SOD活性的降低及趨勢的推遲。根據(jù)細(xì)胞學(xué)觀察，處理1在18～30 d胚性細(xì)胞形成分化期的SOD活性逐漸降低，球形胚形成后期(30～36 d)急劇上升。

圖10 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中SOD活性變化

2.4.3 CAT活性 如圖11所示，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，處理1和處理2的CAT活性整體呈先上升后下降趨勢，并均在30 d快速上升到最大值[382.50、413.50 U/(g·min)]，30～36 d均大幅下降。光CK的CAT活性在0～30 d上升至最大值[187.50 U/(g·min)]后下降；暗CK的CAT活性從0～30 d緩慢下降到最小值[137.50 U/(g·min)]后上升。處理1和處理2的CAT活性始終高于光CK和暗CK，且在30～36 d顯著高于光CK和暗CK；18～24 d 胚性細(xì)胞大量形成期，處理1的CAT活性顯著高于其他處理，30 d球形胚形成期的CAT活性，處理1比光CK提高了104.01%，處理2比暗CK提高了401.52%。同時發(fā)現(xiàn)光照和添加PIC處理協(xié)同促進(jìn)CAT活性的升高，尤其在18～36 d處理1的CAT活性顯著高于處理2(30 d除外)，在24～36 d光CK的CAT活性顯著高于暗CK。

圖11 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中CAT活性變化

2.4.4 APX活性 如圖12所示，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，處理1的APX活性呈“下降—上升”趨勢，于30 d出現(xiàn)最小值[0.45 U/(g·min)]后迅速上升至36 d達(dá)到最大值[0.84 U/(g·min)]；處理2的APX活性呈“上升—下降—上升”趨勢，并于30 d降至最小值[1.21 U/(g·min)]，30～36 d迅速升至最大值[2.03 U/(g·min)]。光CK和暗CK的APX活性均呈“上升—下降—上升”趨勢，并分別在30、 24 d下降到最小值[0.60、1.40 U/(g·min)]后持續(xù)上升。同時發(fā)現(xiàn)光照有助于APX活性的降低，在6～36 d處理2和暗CK的APX活性始終高于處理1和光CK，在18～30 d APX活性急劇下降，各處理在球形胚形成后期(30～36 d)的APX活性均逐漸回升。

圖12 鳳丹白體細(xì)胞胚發(fā)生早期誘導(dǎo)過程中APX活性變化

3 結(jié)論與討論

光照不僅是植物光合作用的能量來源，同時影響著細(xì)胞的分化和形態(tài)發(fā)生。研究表明，體細(xì)胞胚的間接發(fā)生多在黑暗條件下進(jìn)行，而直接發(fā)生多在16 h/8 h 的光/暗交替條件下進(jìn)行[19]。光培養(yǎng)下體細(xì)胞胚生長迅速且健壯，在暗培養(yǎng)下僅部分體細(xì)胞胚在發(fā)育過程中會愈傷組織化，且誘導(dǎo)出的愈傷組織在去掉激素后需要較長的時間才能分化出體細(xì)胞胚[12]。由此可見，光照對愈傷組織培養(yǎng)的作用因植物種類和基因型不同而存在差異。植物組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)劑是影響植株再生的主要因素，PIC的作用機(jī)制與2,4-D類似，是誘導(dǎo)外植體脫分化的生長素之一。近期研究表明，PIC可以代替2,4-D更好地誘導(dǎo)香蕉[20]和洋蔥[21]的胚性愈傷組織產(chǎn)生體細(xì)胞胚。適宜濃度的PIC能夠誘導(dǎo)牡丹[3]和山核桃[22]幼胚產(chǎn)生胚性愈傷組織及體細(xì)胞胚，且進(jìn)一步培養(yǎng)可產(chǎn)生體細(xì)胞胚。本試驗結(jié)果表明，處理1 (光/暗12 h/12 h、PIC 4.0 mg/L)和處理2(光/暗0 h/24 h、PIC 4.0 mg/L)條件下產(chǎn)生的愈傷組織生長迅速；與暗CK(光/暗0 h/24 h、PIC 0 mg/L)相比，處于光CK(光/暗12 h/12 h、PIC 0 mg/L)條件下的愈傷組織長勢較好；處理1條件下的球形胚出現(xiàn)最早。

有研究表明，在北五味子、紅松、橡膠樹和尾巨桉等[23-26]體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，IAA、ABA及GA3含量變化與之相關(guān)。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，處理1條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)18 d形成少量胚性細(xì)胞，24 d出現(xiàn)大量胚性細(xì)胞，30 d出現(xiàn)球形胚，36 d形成少量心形胚。牡丹愈傷組織IAA含量在0～30 d一直呈上升趨勢，這與賴鐘雄等[27]、潘曉等[28]的研究發(fā)現(xiàn)IAA含量升高有助于體細(xì)胞胚的早期發(fā)育一致；外源添加PIC條件下出現(xiàn)胚性愈傷組織較多，且其內(nèi)源IAA的含量水平均遠(yuǎn)高于光CK和暗CK，這與陳以峰等[29]在水稻體細(xì)胞胚研究中發(fā)現(xiàn)內(nèi)源IAA的含量水平在胚性愈傷組織中遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織的結(jié)果一致；外源添加PIC條件下的GA3含量變化整體呈下降趨勢，均于36 d達(dá)到最小值，在36 d心形胚階段降至最低，這與黃道斌[30]在茶樹體細(xì)胞胚發(fā)生研究中發(fā)現(xiàn)GA3含量與胚性細(xì)胞形成呈負(fù)相關(guān)的結(jié)果相似；ABA含量的變化趨勢與IAA的相似，處理1條件下的ABA含量在0～30 d整體上呈上升趨勢，這與崔凱榮等[31]在枸杞體細(xì)胞胚研究中發(fā)現(xiàn)ABA含量升高有助于體細(xì)胞胚的早期發(fā)育一致；外源添加PIC條件下ABA/IAA比值整體呈平穩(wěn)上升趨勢，雖光CK下的ABA/IAA比值在愈傷組織形成中后期高于處理1，但其呈下降趨勢；外源添加PIC條件下的ABA/GA3比值整體呈上升趨勢且在24～36 d開始出現(xiàn)劇烈變化，大幅度上升，即在胚性愈傷組織形成中后期ABA/GA3比值升高；與潘曉等[28]研究發(fā)現(xiàn)香蕉胚性愈傷組織形成中后期ABA/GA3升高有利于香蕉胚性能力的表達(dá)和ABA/IAA升高有利于體細(xì)胞胚發(fā)育成熟一致，表明IAA、GA3、ABA及其比值對牡丹細(xì)胞胚性的啟動、發(fā)生、發(fā)育具有較大的影響。

有研究表明，在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中蛋白質(zhì)、POD、CAT、SOD及APX均參與葡萄風(fēng)信子、胡桃楸和滇楸等[32-34]植物的體細(xì)胞胚發(fā)生。本試驗中，愈傷組織在體細(xì)胞胚發(fā)生過程中，外源添加PIC條件下蛋白質(zhì)合成速率整體呈上升趨勢，分別于30、24 d達(dá)到最大值，此時也正是球形胚的形成時期，蛋白質(zhì)的積累為其提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，這與潘曉等[28]研究結(jié)果一致，說明胚性愈傷組織細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成代謝活躍，可能與體細(xì)胞胚分化過程中可溶性蛋白向結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)化積累有關(guān)[35]；外源添加PIC條件下的POD活性呈“上升—下降”波動趨勢，在30 d達(dá)到最大值，此時正是球形胚的形成時期，表明高POD活性可以促進(jìn)胚性細(xì)胞誘導(dǎo)及體細(xì)胞胚早期發(fā)生，同時說明牡丹球形胚時期的能量代謝旺盛，可以為后期的體細(xì)胞胚發(fā)生提供能量，而高POD活性和蛋白質(zhì)水平為球形胚的大量形成提供了物質(zhì)和能量基礎(chǔ)[36]；外源添加PIC條件下，CAT活性與POD活性的變化趨勢基本一致，這與潘曉等[28]的研究發(fā)現(xiàn)CAT活性的升高能夠促進(jìn)胚性細(xì)胞的形成和早期發(fā)育一致；而外源添加PIC條件下的SOD活性呈“上升—下降—上升”趨勢，分別在30、24 d降到最小，之后又迅速回升，這與王靜等[37]研究木薯體細(xì)胞胚發(fā)生過程中SOD活性變化趨勢一致，表明SOD活性升高有助于胚性細(xì)胞早期發(fā)育，活性降低有助于胚性細(xì)胞分化；外源添加PIC條件下APX活性在12～30 d緩慢下降且降幅很小，30～36 d迅速增加即在誘導(dǎo)胚性愈傷組織及早期體細(xì)胞胚發(fā)生時期變化不明顯，而在體細(xì)胞胚發(fā)育階段迅速增加，與李惠華等[38]的試驗發(fā)現(xiàn)APX活性升高有助于體細(xì)胞胚發(fā)育情況一致。

因此，本研究認(rèn)為光照和外源添加PIC可以顯著提高牡丹胚性愈傷組織形成過程中的IAA含量、蛋白質(zhì)含量、CAT活性、ABA含量、ABA/GA3比值及POD活性，并降低GA3含量和APX活性。而關(guān)于光照和PIC對牡丹體細(xì)胞胚發(fā)生的作用機(jī)制還有待后期進(jìn)一步深入研究。

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