致病性遲緩愛德華氏菌CA26的分離鑒定及其對鯰魚免疫因子的影響

閻 華，王 會，于 博*，黃升謀，李云捷，吳進(jìn)菊，李玉奇

(1.湖北文理學(xué)院 化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院，湖北 襄陽 441053； 2.襄陽市中心醫(yī)院，湖北 襄陽 441053)

鯰魚主要生活在江河、湖泊、水庫、坑塘的中下層，多在沿岸地帶活動，白天多隱于草叢、石塊下或深水底，夜晚覓食活動頻繁。鯰魚為肉食性魚類，捕食對象多為小型魚類，如餐條、鯽魚、鰕虎魚、麥穗魚、鯉魚、泥鰍等。鯰魚肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值豐富，是餐桌上的一道美食，其野生資源因為氣候變化和人為因素影響，已經(jīng)逐漸減少。目前，湖北省長江沿線已形成了具有相當(dāng)規(guī)模的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。但是養(yǎng)殖場主片面追求經(jīng)濟效益，高密度養(yǎng)殖和高蛋白餌料投喂鯰魚，造成鯰魚生長環(huán)境惡化。并且忽視了預(yù)防疾病措施，使得鯰魚傳染性疾病發(fā)病比較嚴(yán)重，有些養(yǎng)殖場發(fā)病率高達(dá)50%以上，造成極大的經(jīng)濟損失。鯰魚血液中礦質(zhì)元素鐵參與合成血紅蛋白，有助于紅細(xì)胞輸送氧氣和二氧化碳，同樣有助于免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，提高巨噬細(xì)胞的殺菌作用。礦質(zhì)元素鐵也是病原微生物生長的必需元素，有助于提高生長速度。基于此，水產(chǎn)動物通過調(diào)控礦質(zhì)元素鐵相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)節(jié)血液中鐵元素質(zhì)量濃度，從而抑制病原微生物的生長。鐵調(diào)素蛋白主要由鐵調(diào)素基因(hepc)表達(dá)，在魚體肝臟細(xì)胞中產(chǎn)生的抗菌肽，抑菌活性很強，這種蛋白質(zhì)主要和機體鐵元素聯(lián)合作用，因此，鐵調(diào)素蛋白含量和鐵元素質(zhì)量濃度有著重要的關(guān)系[1]。白細(xì)胞介素炎癥因子主要由白細(xì)胞介素6基因(il-6)編碼，激活蛋白酪氨酸激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子 (JAK3/STAT3)信號通路從而促進(jìn)鐵調(diào)素基因表達(dá)，有助于鐵調(diào)素發(fā)揮生物學(xué)功能，從而調(diào)節(jié)機體免疫功能[2]。

湖北省武漢市江夏區(qū)鳳陽養(yǎng)殖場暴發(fā)鯰魚傳染性疾病，其魚體表面潰瘍，嚴(yán)重者口鼻充血、流血，解剖后可見其肝臟、脾臟、腎臟腫大。為了解鯰魚發(fā)病原因，通過平板劃線培養(yǎng)的方法對染病鯰魚中致病菌CA26進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行鑒定，檢測健康鯰魚感染致病菌CA26后機體鐵元素質(zhì)量濃度變化，并對肝臟hepc基因、il-6基因、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶基因(jak3)、轉(zhuǎn)錄激活因子基因(stat3)的表達(dá)情況進(jìn)行分析，研究致病菌CA26侵染鯰魚對其免疫因子的影響，明確鐵元素相關(guān)基因和鐵元素質(zhì)量濃度在受感染魚體應(yīng)對致病菌CA26侵染中的具體功能，以期研究致病菌CA26的致病機制，為致病菌CA26的防控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試動物

患病魚：患病鯰魚來源于湖北省武漢市江夏區(qū)鳳陽養(yǎng)殖場，呈典型敗血癥，其主要癥狀為行動遲緩，反應(yīng)遲鈍，不攝食，嚴(yán)重者口鼻充血、腹部出血。解剖魚體可見肝臟、脾臟、腎臟腫大，腸道充血。

健康魚：健康鯰魚從湖北省農(nóng)科院水產(chǎn)養(yǎng)殖基地購買，選擇外表健康的鯰魚幼體，幼魚平均質(zhì)量是150 g，平均長度是25 cm。然后將健康鯰魚隨機劃分為試驗組和對照組，每組有3個平行，每個平行有50尾，總計300尾。

1.2 主要試劑及來源

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂糖、溴化乙錠等均購自上海一基實業(yè)有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自上海英諾生物科技有限公司，氧化酶試劑、API細(xì)菌鑒定試劑條及相關(guān)配套試劑均購自法國梅里埃公司。

1.3 細(xì)菌分離鑒定

1.3.1 細(xì)菌的分離 在無菌條件下從患病鯰魚的肝臟中取樣，營養(yǎng)瓊脂平板劃線分離，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況，若菌落光滑、微凸、圓整、黃色或淡黃色，并有特殊芳香氣味，則為疑似菌落。挑取單菌落進(jìn)行2次純化，將菌落形態(tài)光滑、中間凸起有核、圓形、顏色綠色或深綠色的單菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。分離純化培養(yǎng)的菌株低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)菌的生理生化鑒定 應(yīng)用法國梅里埃生物公司革蘭氏陰性或陽性鑒定試劑條、VITEK-32全自動細(xì)菌鑒定儀對細(xì)菌進(jìn)行生理生化、革蘭氏染色、氧化酶檢測。

1.3.3 細(xì)菌溶血性毒素基因鑒定 細(xì)菌毒素的檢測引物參照文獻(xiàn)[3-5]設(shè)計，由大連寶生物工程公司合成，序列見表1。

細(xì)菌DNA制備根據(jù)制造商的DNA提取試劑盒產(chǎn)品說明進(jìn)行。PCR反應(yīng)溶液(25 μL)包含：12.5 μLTaqMaster Mix、1.0 μLethA引物、1.0 μLethB引物、1.0 μLesaC引物、0.5 μL 16SrRNA引物和1 μL提取DNA，余量為ddH2O。采用下列條件進(jìn)行PCR擴增：95 ℃變性5 min；95 ℃變性30 s,59 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán)周期；最后72 ℃延伸10 min。擴增的DNA片段放置在2%瓊脂糖凝膠上水平電泳，1×TAE緩沖液(0.04 mol/L Tris、0.02 mol/L醋酸、0.002 mol/L Na2EDTA)，使用8 μL PCR產(chǎn)物。凝膠使用1 μL/mL溴化乙錠染色30 min，紫外線光照下觀察?；虼笮?biāo)準(zhǔn)品是采用100個堿基對的DNA梯度標(biāo)記物。

表1 毒素檢測引物序列和目標(biāo)基因

1.4 遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚試驗

將低溫保存的遲緩愛德華氏菌CA26菌株使用平板富集培養(yǎng)基30 ℃培養(yǎng)24 h后，以0.65%高溫高壓滅菌的生理鹽水稀釋成2.0×106cfu/mL的菌體，使用一次性注射器向試驗組鯰魚腹腔中注射0.15 mL的菌體，對照組注射0.15 mL的高溫高壓滅菌的0.65%生理鹽水。注射完成后6、12、24、48、72、84、96 h每個平行收集3尾鯰魚，使用一次性注射器從鯰魚尾部靜脈抽血0.3～0.5 mL。抽血后鯰魚進(jìn)行解剖，獲得的肝臟置于-80 ℃液氮中保存。

1.5 免疫因子測定

1.5.1 血液中鐵元素質(zhì)量濃度的檢測 血液鐵元素質(zhì)量濃度和載鐵蛋白質(zhì)量濃度的檢測根據(jù)血液鐵元素質(zhì)量濃度和載鐵蛋白質(zhì)量濃度檢測試劑盒的說明書進(jìn)行。紫外分光光度計重復(fù)測定樣本3次。

1.5.2 肝臟中鐵元素質(zhì)量濃度的檢測 使用干法消化的方法測定肝臟鐵元素質(zhì)量濃度[6]：鯰魚肝臟解凍完成后，使用高溫高壓滅菌的生理鹽水沖洗3次，然后使用濾紙吸干，稱質(zhì)量后放入坩堝中，以600 ℃高溫馬弗爐灼燒約5 h，樣本出現(xiàn)白色或者灰白色時，自然冷卻到室溫取出，然后加入1∶1的硝酸水混合溶液5 mL，電爐上消化至沸騰，使用濾紙過濾消化液流入50 mL容量瓶，再以雙蒸水反復(fù)沖洗坩堝以及濾紙，使用濾紙過濾流入上述容量瓶中，最后使用雙蒸水定容至刻度，檢測備用。使用ICP-AES儀重復(fù)測定上述樣本3次。

1.5.3 肝臟中鐵元素調(diào)控基因表達(dá)分析 以鯰魚hepc基因cDNA序列、il-6基因cDNA序列、jak3基因cDNA序列、草魚stat3基因cDNA序列設(shè)計相關(guān)引物[7-9]，具體見表2。然后使用RNAiso提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)制備鯰魚肝臟總RNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實時熒光定量PCR。這4種基因的相對表達(dá)量采用二分法進(jìn)行計算，以鯰魚18SrRNA基因的表達(dá)量為基準(zhǔn)。實時熒光定量PCR反應(yīng)溶液包含：10.0 μLTaqMaster Mix、0.4 μL引物、2 μL cDNA模板,其余為ddH2O，總體積20 μL。采用下列條件進(jìn)行擴增：95 ℃變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；每個樣本溶解曲線從55 ℃到95 ℃平行檢測3次。

表2 鯰魚鐵元素調(diào)控基因的實時熒光定量PCR相關(guān)引物序列

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件分析，差異顯著性采用t檢驗[10]。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病鯰魚肝臟中分離得到的細(xì)菌CA26菌落特性和鑒定

2.1.1 菌落特性 從患病鯰魚的肝臟樣本中分離到病原菌，命名為CA26。培養(yǎng)24 h后，可見黃色、濕潤、圓形、略隆起、邊緣整齊的菌落(圖1)。

2.1.2 生理生化反應(yīng)及鑒定結(jié)果 經(jīng)純化分離后的致病病原菌CA26，使用VITEK-32全自動細(xì)菌分析儀進(jìn)行生理生化特性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌具有鞭毛，具有可活動性，革蘭色染色為陰性，細(xì)菌形態(tài)為短桿狀，精氨酸反應(yīng)為陽性，氧化酶反應(yīng)為陽性，醋硫胺反應(yīng)為陽性(表3)。生化反應(yīng)鑒定致病菌CA26為遲緩愛德華氏菌。

2.1.3 遲緩愛德華氏菌CA26中溶血性毒素基因

ethA、ethB和esaC的PCR檢測結(jié)果 使用多重PCR檢測證實，從患病鯰魚肝臟樣本中分離得到的遲緩愛德華氏菌CA26攜帶有溶血性毒素基因ethA、ethB和esaC。遲緩愛德華氏菌CA26的16SrRNA基因PCR擴增產(chǎn)物為498 bp，ethA基因擴增產(chǎn)物為265 bp，ethB基因擴增產(chǎn)物為694 bp，esaC基因擴增產(chǎn)物為324 bp(圖2)。

圖1 患病鯰魚肝臟中分離得到的細(xì)菌CA26培養(yǎng)形態(tài)

項目結(jié)果項目結(jié)果鞭毛+莢膜-革蘭氏染色-香豆酸(COU)-細(xì)菌形態(tài)短桿狀精氨酸(ARG)+氧化酶(OXI)+醋硫胺(ACE)+三氯新(DP3)+色氨酸(TDA)-尿素(URE)-棉子糖(RAF)-麥芽糖(MLT)+硫化氫(H2S)+肌醇(INO)+賴氨酸(LYS)-阿拉伯糖(ARA)+七葉樹素(ESC)+葡萄糖氧化(OFG)+多膝桿菌素(PXB)-枸櫞酸(CIT)-山梨醇(SOR)-甘露醇(MAN)+半乳糖苷酶(ONP)-福壽昔醇(ADO)-鳥氨酸(ORN)-葡萄糖發(fā)酵(GLU)+植物尿藍(lán)母(PLI)+陽性生長控制(GC)+乳糖(LAC)-丙二酸鹽(MAL)-蔗塘(SUC)+木糖(XFL)+鼠李糖(RHA)+

M：DNA標(biāo)準(zhǔn)品；1：遲緩愛德華氏菌CA26圖2 遲緩愛德華氏菌CA26的溶血性毒素基因多重PCR檢測

2.2 遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚后對其免疫因子的影響

2.2.1 血液鐵元素質(zhì)量濃度 圖3為遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚后6～96 h時血液鐵元素質(zhì)量濃度的變化。與對照組相比，血液鐵元素質(zhì)量濃度出現(xiàn)降低。12 h時，血液鐵元素質(zhì)量濃度從3.4 mg/L下降到1.7 mg/L，差異顯著(P<0.05)；24 h時血液鐵元素質(zhì)量濃度從3.7 mg/L下降到1.9 mg/L，差異顯著(P<0.05)。

*表示與對照組比較差異顯著(P<0.05)，下同

2.2.2 血液載鐵蛋白質(zhì)量濃度 從圖4可以看出，與對照組相比，載鐵蛋白質(zhì)量濃度有所增加，但是均沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

圖4 遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚后其血液載鐵蛋白質(zhì)量濃度的變化

2.2.3 肝臟鐵元素質(zhì)量濃度 與對照組相比，肝臟鐵元素質(zhì)量濃度增加，但是沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05)(圖5)。

圖5 遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚后其肝臟鐵元素質(zhì)量濃度的變化

2.2.4 肝臟hepc基因表達(dá)量 鯰魚受到遲緩愛德華氏菌CA26侵染后，其肝臟hepc基因在6～96 h時的表達(dá)量增加，6 h時表達(dá)量是對照組的4.5倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)；12 h時表達(dá)量是對照組的4.3倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)；24 h時表達(dá)量是對照組的4.1倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)(圖6)。

圖6 遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚后其肝臟hepc基因表達(dá)量的變化

2.2.5 肝臟il-6基因表達(dá)量 鯰魚受到遲緩愛德華氏菌CA26侵染后，其肝臟il-6基因在6～96 h時表達(dá)量增加，6 h時表達(dá)量是對照組的3.1倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)；12 h時表達(dá)量是對照組的3.3倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05);24 h時表達(dá)量是對照組的3.5倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)(圖7)。

圖7 遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚后其肝臟il-6基因表達(dá)量的變化

2.2.6 肝臟jak3基因表達(dá)量 鯰魚受到遲緩愛德華氏菌CA26侵染后，其肝臟jak3基因在6～96 h時表達(dá)量增加， 12 h表達(dá)量是對照組的3.2倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，但未達(dá)到極顯著水平(P>0.01)(圖8)。

圖8 遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚后其肝臟jak3基因表達(dá)量的變化

2.2.7 肝臟stat3基因表達(dá)量 鯰魚受到遲緩愛德華氏菌CA26侵染后，其肝臟stat3基因在6～96 h時表達(dá)量增加， 6 h表達(dá)量是對照組的4.8倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)；12 h時表達(dá)量是對照組的5.2倍，達(dá)到顯著水平(P<0.05)(圖9)。

圖9 遲緩愛德華氏菌CA26侵染鯰魚后其肝臟stat3基因表達(dá)量的變化

3 結(jié)論與討論

遲緩愛德華氏菌又稱遲鈍愛德華氏菌或緩慢愛德華氏菌，屬于腸桿菌科的愛德華氏菌屬，是愛德華氏菌屬細(xì)菌家族中較早發(fā)現(xiàn)的成員之一。近年來，遲緩愛德華氏菌不僅是嚴(yán)重危害水產(chǎn)動物的致病菌，已經(jīng)在20多種魚類中引起了病害，如鰻鱺、牙鲆、羅非魚等，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了巨大損失；也是一種人、魚共患病原菌，直接對人類健康造成了威脅[9]。遲緩愛德華氏菌有鞭毛、能運動、無莢膜，革蘭氏染色陰性兼性厭氧桿菌。在4～10 ℃能夠生長，最適生長溫度為25～32 ℃[11]。遲緩愛德華氏菌現(xiàn)在已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)主要存在2種溶血性毒素，分別是由氣溶素基因(ethA和ethB)和溶血素基因(esaC)編碼的氣溶素和溶血素。遲緩愛德華氏菌中溶血性毒素會破壞寄主細(xì)胞膜，使得細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，最終引發(fā)寄主細(xì)胞死亡。

鯰魚血液中鐵元素可以參與機體多種酶類的合成，同時也合成血紅蛋白，作為氧氣和二氧化碳運輸載體，同時也有助于免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，提高巨噬細(xì)胞的吞噬作用。礦質(zhì)元素鐵也是病原微生物生長必需元素，有助于提高其生長速度[12]。致病菌和寄主鯰魚之間通過競爭作用，可以在鐵元素質(zhì)量濃度上達(dá)到平衡狀態(tài)。通過鐵元素相關(guān)基因調(diào)節(jié)作用，減少機體游離鐵元素質(zhì)量濃度，增加結(jié)合鐵元素質(zhì)量濃度，從而降低致病菌的生長速度以減少其危害程度。

本研究采用平板劃線培養(yǎng)的方法對湖北省武漢市江夏區(qū)鳳陽養(yǎng)殖場患病鯰魚肝臟進(jìn)行致病菌的分離純化，在營養(yǎng)瓊脂平板上獲得形態(tài)完全一致的菌落，將該菌株命名為CA26。全自動細(xì)菌分析儀鑒定結(jié)果為遲緩愛德華氏菌。遲緩愛德華氏菌CA26人工感染鯰魚試驗中出現(xiàn)的癥狀與自然病例基本相同。分離菌具有溶血性遲緩愛德華氏菌的典型特征，能分泌具有溶血性、腸毒性和細(xì)胞毒性的毒素因子，并能廣泛地侵襲健康鯰魚腎、脾、肺、肝、肌肉和血液等組織器官，造成廣泛性出血和全身性器官病變，包括出現(xiàn)腫脹、顆粒變性、玻璃樣變、壞死崩解以及紅細(xì)胞破裂。患病鯰魚經(jīng)肉眼觀察，體表出現(xiàn)潰瘍、疤痕，嚴(yán)重的產(chǎn)生口鼻充血、流血，解剖后其內(nèi)臟肝、脾、腎腫大，腸道充血。本研究使用VITEK-32全自動細(xì)菌分析儀進(jìn)行鑒定，并用特定的ethA、ethB和esaC基因引物進(jìn)行多重PCR，證實遲緩愛德華氏菌CA26攜帶有氣溶素和溶血素基因。

本研究檢測發(fā)現(xiàn)，鯰魚受到遲緩愛德華氏菌CA26侵染后，其肝臟hepc、il-6、jak3和stat3基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著增加，證明這些基因都有助于鯰魚機體的免疫反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)控體內(nèi)鐵元素質(zhì)量濃度。hepc基因的表達(dá)產(chǎn)物有助于抑制腸道鐵元素的吸收和肝臟鐵的釋放以降低游離鐵元素質(zhì)量濃度。前人研究發(fā)現(xiàn)，大菱鲆受到遲緩愛德華氏菌侵染后，肝、脾、鰓等組織器官hepc基因的表達(dá)量顯著升高[10]。鱸魚受到鏈球菌侵染后，肝細(xì)胞hepc基因mRNA水平明顯增加[11]。本研究結(jié)果與前人基本一致，健康鯰魚受到遲緩愛德華氏菌CA26侵染后，肝臟hepc基因表達(dá)量有所增加，6、12、24 h時達(dá)到顯著水平。肝臟il-6基因表達(dá)量增加，6、12、24 h時達(dá)到顯著水平。肝臟jak3基因的表達(dá)量增加，12 h達(dá)到顯著水平。肝臟stat3基因的表達(dá)量增加，6、12 h時達(dá)到顯著水平。因此，il-6炎性因子結(jié)合小分子受體后可激活jak3基因，然后激活stat3基因，最后調(diào)控hepc基因的表達(dá)，從而控制鯰魚鐵元素質(zhì)量濃度。

綜上，湖北省武漢市江夏區(qū)鳳陽養(yǎng)殖場的鯰魚致病菌屬于溶血性遲緩愛德華氏菌，健康鯰魚受到遲緩愛德華氏菌CA26侵染后，hepc基因、il-6基因、jak3基因、stat3基因等表達(dá)量均上升，從而降低鯰魚血液鐵元素質(zhì)量濃度，并增加血液載鐵蛋白質(zhì)量濃度，并增加肝臟鐵元素質(zhì)量濃度，有利于提高其機體免疫能力。

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