• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬Gasp1和Gasp2基因?qū)2C12細(xì)胞分化的影響

    2018-05-17 02:42:58樊爽爽張雪梅劉曉賀劉姣揚(yáng)明勝利褚貝貝楊國宇
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒分化試劑盒

    樊爽爽,張雪梅,劉曉賀,劉姣揚(yáng),明勝利,褚貝貝,楊國宇,王 江

    (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

    在骨骼肌的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中,肌肉生長(zhǎng)抑制素 (Myostatin,MSTN) 是一種重要的細(xì)胞因子,參與肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控[1]。肌肉細(xì)胞分化復(fù)雜過程的順利進(jìn)行是由一組特異的成肌調(diào)控因子、生長(zhǎng)因子、激酶等精確調(diào)控來完成的,這一過程中生肌調(diào)節(jié)因子(MyoD)、肌細(xì)胞生成素(MyoG)、細(xì)胞周期抑制物(P21)、肌球重鏈蛋白(MHC)等基因發(fā)揮著重要作用[2-6]。MyoD蛋白和生肌決定因子(Myf5)是生肌調(diào)節(jié)因子家族(MyoGenic regulatory factors,MRFs)的成員。自Wyzykowski等[7]首次克隆人MyoD基因, 其在促使平滑肌細(xì)胞、原代培養(yǎng)的成軟骨細(xì)胞等骨骼肌細(xì)胞分化中的作用陸續(xù)被證實(shí)[8]。MyoG蛋白為肌細(xì)胞生成素,是轉(zhuǎn)錄因子MyoD家族的成員之一,在MyoD、Myf5下游表達(dá),進(jìn)而終止細(xì)胞增殖,是骨骼肌發(fā)育的正調(diào)控因子,具有調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞融合形成多核肌管的分化標(biāo)志特征[9-11]。P21作為衰老細(xì)胞衍生的抑制蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞衰老過程。在成肌細(xì)胞分化過程中,細(xì)胞周期抑制物P21基因的特征變化是表達(dá)顯著增強(qiáng),提示細(xì)胞不可逆地退出細(xì)胞周期[12]。有研究表明,體外培養(yǎng)細(xì)胞中,MyoD能夠增加MHC報(bào)道基因的表達(dá)[3-6]。Gasp1(Growth and differentiation factor-associated serum protein-1) 蛋白和Gasp2蛋白是卵泡抑素亞家族成員,具有2個(gè)相似的蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域[13]。通過熒光素酶報(bào)告基因分析,Gasp1蛋白被證實(shí)具有抑制成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素生物活性[14]。Gasp1和Gasp2蛋白可以強(qiáng)有力結(jié)合生長(zhǎng)因子TGF1 (Transforming growth factor-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,Bmp2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(Bone morphogenetic protein-4,Bmp4),但是卻并不抑制它們的信號(hào)通路活性[15],同時(shí)還可以阻斷MSTN蛋白等配體的活性,進(jìn)而促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育[16-17]。Gasp1和Gasp2基因雖然在編碼蛋白質(zhì)上高度同源,但在人機(jī)體各個(gè)組織中表達(dá)存在差異,進(jìn)而提示兩者可能具有不同的生物學(xué)功能。此外,許多基于小鼠模型的研究指出,Gasp1基因可以直接但不獨(dú)立地結(jié)合成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素、肌肉生長(zhǎng)抑制素前肽,從而抑制肌肉生長(zhǎng)抑制素活性,促進(jìn)細(xì)胞分化[18-19]。目前,關(guān)于Gasp1和Gasp2在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中參與的分子機(jī)制研究較少,在豬的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)控中的作用尚不清楚。為此,研究Gasp基因?qū)2C12細(xì)胞分化的影響,為進(jìn)一步選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑 Q5 PCR高保真擴(kuò)增酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;DNA切膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;質(zhì)粒中提試劑盒購自QIAGEN公司;Trizol、轉(zhuǎn)染試劑Turbofect購自Thermo公司;高糖DMEM培養(yǎng)基、孕馬血清購自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司;T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、SYBGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、rTaq酶、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司;嘌呤霉素(Puromycin)購自Sigma公司; phiC31質(zhì)粒購自SBI公司;EB替代物購自上海萊楓生物科技有限公司。

    1.1.2 試驗(yàn)材料 小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)、杜長(zhǎng)大三元豬組織為本實(shí)驗(yàn)室保存。采用常規(guī)方法取豬的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、十二指腸、直腸、回腸、肌肉等8種組織,在液氮中速凍,保存于-80 ℃冰箱。

    1.2 方法

    1.2.1 豬組織總RNA的提取及cDNA的合成 用Trizol試劑提取1.1.2中組織的RNA,用微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和濃度。 以提取的總 RNA 為模板,取1 μg總RNA,使用TakaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,-20 ℃保存。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫檢索得到豬Gasp1和Gasp2基因(GenBank No.:XM_021064627、XM_021083248)的cDNA序列及其相關(guān)信息。根據(jù)豬Gasp1和Gasp2基因的序列采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,克隆引物序列見表1,實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表2。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2.3Gasp1和Gasp2基因的克隆 以豬肌肉組織cDNA作為模板,用Q5 PCR高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行目的基因Gasp1和Gasp2的擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),然后用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收,回收的PCR產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光值,初步確定擴(kuò)增的Gasp1和Gasp2基因的質(zhì)量,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 基因克隆引物

    注:F中下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn),R中下劃線部分為NheⅠ酶切位點(diǎn)。

    表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

    1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NheⅠ分別對(duì)PCR擴(kuò)增的Gasp1和Gasp2基因以及phiC31載體進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收相應(yīng)大小的目的片段。按T4連接酶說明書進(jìn)行目的片段和phiC31載體的連接,連接體系為:純化的Gasp1和Gasp2基因片段6 μL,雙酶切phiC31載體片段1 μL,T4連接酶1 μL,T4連接酶Buffer 2 μL,體系配制完成后,充分混勻各組分,16 ℃反應(yīng)過夜。第2天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)100 μg/mL 嘌呤霉素篩選、菌液PCR檢測(cè)和測(cè)序來鑒定陽性重組質(zhì)粒。將測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng),按照QIAGEN試劑盒說明書提質(zhì)粒。

    1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前8 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12細(xì)胞以 2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)75%融合度時(shí),按phiC31、phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2重組質(zhì)粒各2 μg、轉(zhuǎn)染試劑Turbofect 4 μL、DMEM培養(yǎng)基200 μL反應(yīng)體系加入試驗(yàn)組孔中,設(shè)置空白對(duì)照組C2C12、試驗(yàn)組C2C12-phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2及陰性對(duì)照組C2C12-phiC31。6 h左右換液,48 h后加入含有最佳篩選質(zhì)量濃度為4 μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),以殺死沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)含嘌呤霉素篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞。培養(yǎng)2周后,用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)。

    1.2.6 細(xì)胞增殖速度測(cè)定 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合度時(shí),將試驗(yàn)組C2C12- phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2、陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞,接種到96孔板中。每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)重復(fù),共5 d,以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。然后將培養(yǎng)板放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖速率按CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。記錄檢測(cè)的吸光度值,取平均值,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度A值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

    1.2.7 C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 培養(yǎng)C2C12細(xì)胞時(shí),待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí),將生長(zhǎng)培養(yǎng)基換為含有2%馬血清的分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。每個(gè)試驗(yàn)組分1、2、3、4、5、6 d共6個(gè)時(shí)期,分別在細(xì)胞分化1、2、3、4、5 d時(shí)收集細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MyoD、MyoG、P21及MHC肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)變化。

    1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá) 將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞系C2C12-phiC31、C2C12-phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2接種到6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合度時(shí),按試劑盒說明使用Trizol一步法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將各試驗(yàn)組細(xì)胞cDNA樣品作為反應(yīng)模板進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為:cDNA 1.25 μL,SYBR MIX 5 μL,上下游引物各0.1 μL,ddH2O 3.55 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率,根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性。以GAPDH為內(nèi)參,以設(shè)置的對(duì)照組mRNA表達(dá)量作為對(duì)照組,對(duì)目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

    1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 熒光定量結(jié)果應(yīng)用MXPro-MX3000P 軟件(Stratagene,美國)進(jìn)行分析處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及熒光曲線的Ct值,采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,并利用GraphPad Prism 5.0軟件和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Gasp1和Gasp2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

    采用Trizol法從豬肌肉組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以肌肉cDNA為模板擴(kuò)增豬Gasp1和Gasp2基因編碼區(qū),經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在1 755 bp和1 659 bp處有特異性條帶出現(xiàn),目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符 (圖1)。

    M:DL2000 DNA Marker;1:Gasp1基因;2:Gasp2基因

    2.2 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

    使用BamHⅠ、NheⅠ限制性內(nèi)切酶分別對(duì)phiC31載體和2.1中PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收相應(yīng)目的片段。T4連接酶16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化,挑選陽性單菌落送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序正確后,擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,用BamHⅠ、NheⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)中提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,獲得phiC31和目的基因相對(duì)應(yīng)的大小片段(圖2)。

    M:DL5000 DNA Marker;1:重組質(zhì)粒phiC31-Gasp1;2:重組質(zhì)粒phiC31-Gasp2

    2.3 Gasp1和Gasp2基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

    待細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí),將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,用含4 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選,篩選2周后,未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的C2C12細(xì)胞死亡,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞大量增殖,在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光充滿視野。結(jié)果表明,成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)C2C12-phiC31、C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2的細(xì)胞系(圖3)。

    A:空白對(duì)照;B:C2C12-phiC31;C:C2C12-phiC31-Gasp1;D:C2C12-phiC31-Gasp2

    2.4 Gasp1和Gasp2基因過表達(dá)對(duì)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

    在生長(zhǎng)至第2、3天時(shí),細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1 和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力強(qiáng)于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞。而到第5天后,細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力低于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞(圖4)。

    圖4 過表達(dá)Gasp1和Gasp2基因?qū)2C12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

    2.5 Gasp1和Gasp2基因過表達(dá)對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響

    在誘導(dǎo)分化2 d后直到分化末期,穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2的C2C12細(xì)胞的MyoG、MHC、P21基因表達(dá)量相對(duì)于同期對(duì)照組顯著增強(qiáng)。在分化初期MyoD表達(dá)無差異,分化末期穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2的C2C12細(xì)胞MyoD表達(dá)量顯著增強(qiáng)。同時(shí)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2對(duì)C2C12細(xì)胞分化的促進(jìn)效果顯著 (圖5、6)。

    *表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同

    圖6 穩(wěn)定表達(dá)Gasp2對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響

    3 結(jié)論與討論

    肌肉質(zhì)量和功能的改善對(duì)于選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系具有重大的意義[20-21]。卵泡抑素(Follistatin,F(xiàn)ST)作為一種有效的肌肉生長(zhǎng)抑制素拮抗劑,在小鼠中的過表達(dá)可以促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)[16,22]。生長(zhǎng)和分化因子相關(guān)的分泌蛋白Gasp1,含有與蛋白酶抑制性蛋白相關(guān)的多個(gè)結(jié)構(gòu)域,也含有高度保守的半胱氨酸富集序列,稱為卵泡抑素結(jié)構(gòu)域。有研究顯示,F(xiàn)ST相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)與卵泡抑素高度相似,在體外均可以抑制激活素和多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白[13]。Hill等[14]研究顯示,Gasp1能夠直接且獨(dú)立地與成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素和肌生長(zhǎng)抑制素前肽結(jié)合,并在體外抑制肌生成抑制素活性。Gasp1和Gasp2蛋白具有54%的同源性,并且在包括骨骼肌在內(nèi)的相似組織中表達(dá)(少數(shù)例外)[23]。與其同源蛋白Gasp2一樣,Gasp1對(duì)調(diào)節(jié)軸骨架中前/后模式的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子(Growth differentination factor 11,GDF11)也有很高的親和力。與Gasp1不同,Gasp2從未被發(fā)現(xiàn)與血清肌肉生長(zhǎng)抑制素相關(guān),盡管它們的相互作用是眾所周知的[24]。本試驗(yàn)利用真核表達(dá)載體phiC31551A過表達(dá),不需要外界化學(xué)能源和蛋白質(zhì)輔助因子、適合大片段基因有效整合,可在多種真核細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮自主作用,并使轉(zhuǎn)基因持續(xù)高效表達(dá),外源基因進(jìn)入細(xì)胞后能夠與細(xì)胞基因組整合進(jìn)而產(chǎn)生永久性表達(dá)[25-26],從而獲得穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2基因的細(xì)胞株。成肌細(xì)胞的增殖和分化是一個(gè)相互拮抗的過程[27],這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示,豬Gasp1和Gasp2基因在促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化的后期,細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力低于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MyoD、MyoG、P21及MHC分化相關(guān)基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)Gasp1、Gasp2基因可以促進(jìn)肌肉細(xì)胞分化,為進(jìn)一步闡明豬Gasp1、Gasp2基因在肌肉分化中的分子機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)為選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系奠定了理論基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] Thomas M,Langley B,Berry C,etal.Myostatin,a negative regulator of muscle growth,functions by inhibiting myoblast proliferation [J].J Biol Chem,2000,275(51):40235-40243.

    [2] Buckingham M,Tajbakhsh S.Expression of MyoGenic factors in the mouse:myf-5,the first member of theMyoDgene family to be transcribed during skeletal MyoGenesis [J].C R Acad Sci Ⅲ,1993,316(9):1032-1046.

    [3] Lassar A B,Skapek S X,Novitch B.Regulatory mechanisms that coordinate skeletal muscle differentiation and cell cycle withdrawal [J].Curr Opin Cell Biol,1994,6(6):788-794.

    [4] Miyake M,Hayashi S,Iwasaki S,etal.TIEG1 negatively controls the myoblast pool indispensable for fusion during MyoGenic differentiation of C2C12 cells[J].J Cell Physiol,2011,226(4):1128-1136.

    [5] Muscat G E,Rea S,Downes M.Identification of a regulatory function for an orphan receptor in muscle:COUP-TF Ⅱ affects the expression of theMyoDgene family during MyoGenesis [J].Nucleic Acids Res,1995,23(8):1311-1318.

    [6] Davis R L,Weintraub H,Lassar A B.Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts [J].Cell,1987,51(6):987-1000.

    [7] Wyzykowski J C,Winata T I,Mitin N,etal.Identification of novelMyoDgene targets in proliferating myogenic stem cells [J].Mol Cell Biol,2002,22(17):6199-6208.

    [8] Wright W E,Sassoon D A,Lin V K.MyoGenin,a factor regulating myogenesis,has a domain homologous toMyoD[J].Cell,1989,56(4):607-617.

    [9] Weintraub H,Davis R,Tapscott S,etal.TheMyoDgene family:Nodal point during specification of the muscle cell lineage [J].Science,1991,251(4995):761-766.

    [10] Ott M O,Bober E,Lyons G,etal.Early expression of the myogenic regulatory gene,myf-5,in precursor cells of skeletal muscle in the mouse embryo [J].Development,1991,111(4):1097-1107.

    [11] Gartel A L,Radhakrishnan S K.Lost in transcription:P21 repression,mechanisms,and consequences [J].Cancer Res,2005,65(10):3980-3985.

    [12] Spiller M P,Kambadur R,Jeanplong F,etal.Themyostatingene is a downstream target gene of basic helix-loop-helix transcription factorMyoD[J].Mol Cell Biol,2002,22(20):7066-7082.

    [13] Tsuchida K,Arai K Y,Kuramoto Y,etal.Identification and characterization of a novel follistatin-like protein as a binding protein for the TGF-beta family[J].J Biol Chem,2000,275(52):40788-40796.

    [14] Hill J J,Qiu Y,Hewick R M,etal.Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1:A novel protein with protease inhibitor and follistatin domains[J].Mol Endocrinol,2003,17(6):1144-1154.

    [15] Szlama G,Kondas K,Trexler M,etal.WFIKKN1 and WFIKKN2 bind growth factors TGFbeta1,BMP2 and BMP4 but do not inhibit their signalling activity[J].FEBS J,2010,277(24):5040-5050.

    [16] Haidet A M,Rizo L,Handy C,etal.Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single gene administration of myostatin inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(11):4318-4322.

    [17] Monestier O,Brun C,Heu K,etal.UbiquitousGasp1 overexpression in mice leads mainly to a hypermuscular phenotype[J].BMC Genomics,2012,13:541.

    [18] Barberi L,Dobrowolny G,Pelosi L,etal.Muscle involvement and IGF-1 signaling in genetic disorders:New therapeutic approaches[J].Endocr Dev,2009,14:29-37.

    [19] Guardiola O,Lafuste P,Brunelli S,etal.Criptoregulates skeletal muscle regeneration and modulates satellite cell determination by antagonizing myostatin[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(47):3231-3240.

    [20] Minetti G C,Colussi C,Adami R,etal.Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors[J].Nat Med,2006,12:1147-1150.

    [21] Kota J,Handy C R,Haidet A M,etal.Follistatin gene delivery enhances muscle growth and strength in nonhuman primates[J].Sci Transl Med,2009,1:6-15.

    [22] Lee S J,McPherron A C.Regulation of myostatin activity and muscle growth[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:9306-9311.

    [23] Kondás K,Szláma G,Trexler M,etal.Both WFIKKN1 and WFIKKN2 have high affinity for growth and differentiation factors 8 and 11[J].J Biol Chem,2008,283:23677-23684.

    [24] Trexler M,Bányai L,Patthy L.Distinct expression pattern of two related human proteins containing multiple types of protease-inhibitory modules[J].Biol Chem,2002,383:223-228.

    [25] Sarkar A,Sim C,Hong Y S,etal.Molecular evolutionary analysis of the widespread piggy Bac transposon family and related “domesticated” sequences [J].Mol Genet Genom,2003,270(2):173-180.

    [26] Calos M P.The phiC31 integrase system for gene therapy [J].Curr Gene Ther,2006,6(6):633-645.

    [27] Olson E N,Brennan T J,Chakraborty T,etal.Molecular control of myogenesis:Antagonism between growth and differentiation[J].Mol Cell Biochem,1991,104(1/2):7-13.

    猜你喜歡
    質(zhì)粒分化試劑盒
    兩次中美貨幣政策分化的比較及啟示
    分化型甲狀腺癌切除術(shù)后多發(fā)骨轉(zhuǎn)移一例
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    Cofilin與分化的研究進(jìn)展
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
    成人黄色视频免费在线看| 99热这里只有是精品50| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产成人精品婷婷| 国产av码专区亚洲av| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 午夜91福利影院| 国精品久久久久久国模美| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲中文av在线| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久av网站| 日韩一区二区视频免费看| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲av日韩在线播放| 精品一品国产午夜福利视频| 少妇熟女欧美另类| 各种免费的搞黄视频| 亚洲av国产av综合av卡| 成年人免费黄色播放视频 | 六月丁香七月| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产精品嫩草影院av在线观看| 香蕉精品网在线| 日本91视频免费播放| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品人妻久久久久久| 久久精品国产自在天天线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美精品国产亚洲| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 欧美最新免费一区二区三区| h日本视频在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 久久av网站| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成人免费观看视频高清| 亚洲成人av在线免费| 制服丝袜香蕉在线| 中文字幕人妻丝袜制服| 女人久久www免费人成看片| 看十八女毛片水多多多| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美xxⅹ黑人| 国产精品一区二区性色av| 成人毛片60女人毛片免费| 午夜日本视频在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久99精品国语久久久| 日本午夜av视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 夫妻午夜视频| 国产精品女同一区二区软件| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲国产精品成人久久小说| 最近2019中文字幕mv第一页| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av不卡在线观看| 免费看日本二区| 特大巨黑吊av在线直播| 内地一区二区视频在线| 99热6这里只有精品| 我要看黄色一级片免费的| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲美女视频黄频| 午夜av观看不卡| 亚洲天堂av无毛| 亚洲美女视频黄频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| av福利片在线观看| kizo精华| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 妹子高潮喷水视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 一本久久精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久国产一区二区| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久久久精品精品| av国产久精品久网站免费入址| 18禁在线无遮挡免费观看视频| av不卡在线播放| 国产69精品久久久久777片| 欧美成人午夜免费资源| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久精品久久久久久久性| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久99热6这里只有精品| 午夜激情福利司机影院| 国产日韩欧美视频二区| 久久精品国产亚洲网站| 青春草国产在线视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99久久人妻综合| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产亚洲91精品色在线| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲av.av天堂| 国产成人精品无人区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 制服丝袜香蕉在线| 男人舔奶头视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品国产一区二区久久| 中国三级夫妇交换| 2018国产大陆天天弄谢| 精品少妇内射三级| 日本黄色片子视频| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲精品一区蜜桃| 18+在线观看网站| 久久久国产精品麻豆| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲av不卡在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 丁香六月天网| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产色婷婷99| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 一级黄片播放器| 下体分泌物呈黄色| 亚洲国产色片| 曰老女人黄片| 2021少妇久久久久久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 一区二区三区免费毛片| 狂野欧美激情性bbbbbb| 欧美xxxx性猛交bbbb| 人妻少妇偷人精品九色| 女性被躁到高潮视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲精品第二区| 国产免费视频播放在线视频| 久久久久久久精品精品| 久久6这里有精品| 国产成人aa在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 91成人精品电影| 欧美高清成人免费视频www| 国产一区二区三区综合在线观看 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产午夜精品一二区理论片| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产视频首页在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 免费观看无遮挡的男女| 老司机亚洲免费影院| 色视频www国产| 亚洲图色成人| 国产在线男女| www.av在线官网国产| 国产成人精品久久久久久| 交换朋友夫妻互换小说| 国产伦精品一区二区三区四那| 高清在线视频一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 下体分泌物呈黄色| 一级毛片我不卡| 另类精品久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 婷婷色av中文字幕| 久久韩国三级中文字幕| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久午夜福利片| 下体分泌物呈黄色| 欧美成人午夜免费资源| 亚洲人成网站在线观看播放| h日本视频在线播放| 在线观看av片永久免费下载| 最新中文字幕久久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 校园人妻丝袜中文字幕| 天堂8中文在线网| 久久青草综合色| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日韩中字成人| 成人国产av品久久久| 成人国产av品久久久| 久久久午夜欧美精品| 亚洲欧美精品专区久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲精品亚洲一区二区| freevideosex欧美| 精华霜和精华液先用哪个| 一区二区av电影网| 色哟哟·www| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久久国产精品人妻一区二区| 中文字幕制服av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 十八禁网站网址无遮挡 | 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产伦精品一区二区三区视频9| 午夜激情久久久久久久| 91精品国产国语对白视频| 日日爽夜夜爽网站| 精品人妻熟女av久视频| 成年av动漫网址| 人人妻人人看人人澡| 国产熟女欧美一区二区| 一区二区三区精品91| 亚洲av福利一区| 国产高清有码在线观看视频| 午夜91福利影院| 色视频www国产| 精品一品国产午夜福利视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲av综合色区一区| 三级国产精品片| 老熟女久久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 两个人免费观看高清视频 | 亚洲天堂av无毛| av免费观看日本| 国产极品天堂在线| 精品国产一区二区久久| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲va在线va天堂va国产| 18禁动态无遮挡网站| 中文资源天堂在线| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲怡红院男人天堂| 天堂8中文在线网| 成年人午夜在线观看视频| av女优亚洲男人天堂| videos熟女内射| 亚洲av不卡在线观看| 十八禁高潮呻吟视频 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| av福利片在线观看| 在线观看av片永久免费下载| av免费观看日本| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久精品94久久精品| 黄色毛片三级朝国网站 | av福利片在线观看| 久久热精品热| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| √禁漫天堂资源中文www| 国产黄片视频在线免费观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 极品教师在线视频| 青春草视频在线免费观看| 欧美人与善性xxx| 最近中文字幕2019免费版| av在线观看视频网站免费| 国产一区二区三区av在线| 男女国产视频网站| 久久久久精品性色| 亚洲精品第二区| 如何舔出高潮| 成人综合一区亚洲| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品熟女久久久久浪| 嘟嘟电影网在线观看| av黄色大香蕉| 不卡视频在线观看欧美| .国产精品久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产成人精品婷婷| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产中年淑女户外野战色| 精品一区二区三卡| av.在线天堂| 国产伦精品一区二区三区视频9| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久热这里只有精品99| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 久久 成人 亚洲| 亚洲av不卡在线观看| 老熟女久久久| 亚洲第一av免费看| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产永久视频网站| 一级片'在线观看视频| 多毛熟女@视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费在线观看成人毛片| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 日韩人妻高清精品专区| 在线观看三级黄色| 午夜福利影视在线免费观看| 老熟女久久久| .国产精品久久| 草草在线视频免费看| 亚洲高清免费不卡视频| 中文字幕免费在线视频6| www.av在线官网国产| 69精品国产乱码久久久| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 免费观看的影片在线观看| 青春草国产在线视频| 99久久精品一区二区三区| 亚洲人成网站在线观看播放| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲精品亚洲一区二区| 美女主播在线视频| 国产精品三级大全| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲精品456在线播放app| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 2022亚洲国产成人精品| 少妇的逼好多水| 最近手机中文字幕大全| 九九爱精品视频在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | av又黄又爽大尺度在线免费看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美xxxx性猛交bbbb| 午夜影院在线不卡| 老司机影院毛片| 一区二区av电影网| 日本爱情动作片www.在线观看| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲国产精品国产精品| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品国产三级专区第一集| 成人特级av手机在线观看| 免费在线观看成人毛片| kizo精华| 国产熟女午夜一区二区三区 | 丰满迷人的少妇在线观看| av卡一久久| 另类精品久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 欧美精品一区二区大全| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲四区av| 精品久久久噜噜| 亚洲欧美日韩东京热| av在线观看视频网站免费| 国产综合精华液| 婷婷色av中文字幕| 久久久国产精品麻豆| 女人精品久久久久毛片| 精品国产国语对白av| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产成人精品无人区| 国产精品三级大全| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美日本中文国产一区发布| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 丰满少妇做爰视频| 91精品国产九色| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产男女内射视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品伦人一区二区| 精品视频人人做人人爽| 中文字幕人妻丝袜制服| 婷婷色综合大香蕉| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 插阴视频在线观看视频| 国产淫语在线视频| 国产成人精品无人区| 亚洲精品国产成人久久av| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品酒店卫生间| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久亚洲国产成人精品v| 观看av在线不卡| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 男女免费视频国产| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲av综合色区一区| 色94色欧美一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲三级黄色毛片| 天天操日日干夜夜撸| 日韩精品有码人妻一区| 91久久精品国产一区二区成人| 午夜精品国产一区二区电影| 五月开心婷婷网| 中国三级夫妇交换| 亚洲av免费高清在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 国产精品一区二区性色av| 男女边吃奶边做爰视频| 国产日韩欧美视频二区| 内射极品少妇av片p| 精品国产乱码久久久久久小说| 午夜老司机福利剧场| 久久久久久久亚洲中文字幕| freevideosex欧美| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲av不卡在线观看| 熟女电影av网| av一本久久久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲在久久综合| 永久网站在线| 精品一区二区免费观看| 国内精品宾馆在线| 内射极品少妇av片p| 日本wwww免费看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久久精品久久久久真实原创| av卡一久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 两个人的视频大全免费| 色哟哟·www| 亚洲成人一二三区av| av福利片在线观看| 欧美另类一区| 久久久久久人妻| 亚洲经典国产精华液单| 少妇的逼好多水| 久久久久久久大尺度免费视频| 在线天堂最新版资源| 成人影院久久| 亚洲美女搞黄在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 91久久精品国产一区二区成人| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 五月伊人婷婷丁香| 一本一本综合久久| 久久久久国产网址| 国产精品免费大片| 三上悠亚av全集在线观看 | av国产精品久久久久影院| 香蕉精品网在线| av福利片在线观看| 女人精品久久久久毛片| 99久久精品国产国产毛片| 日本欧美视频一区| 久久99一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 国产69精品久久久久777片| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 男人爽女人下面视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲无线观看免费| 在线观看三级黄色| 成人二区视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 精品久久久久久电影网| 嫩草影院入口| 午夜免费观看性视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 在线 av 中文字幕| 伊人久久精品亚洲午夜| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美丝袜亚洲另类| 免费观看在线日韩| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久久a久久爽久久v久久| av播播在线观看一区| 老司机亚洲免费影院| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美精品国产亚洲| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美精品一区二区大全| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩中文字幕视频在线看片| 91精品国产九色| 高清黄色对白视频在线免费看 | 黄色欧美视频在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99视频精品全部免费 在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 青春草视频在线免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲精品第二区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 高清不卡的av网站| 夜夜爽夜夜爽视频| 99热国产这里只有精品6| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久久久久久久久久免费av| 精品一区在线观看国产| tube8黄色片| 看非洲黑人一级黄片| 99热全是精品| 我的老师免费观看完整版| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜福利,免费看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 夜夜骑夜夜射夜夜干| 少妇高潮的动态图| 9色porny在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产亚洲91精品色在线| 99热这里只有精品一区| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 亚洲av成人精品一区久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 男女免费视频国产| 99九九在线精品视频 | 亚洲国产精品一区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久午夜欧美精品| 国产淫片久久久久久久久| 久久久久久久久久成人| 黑人高潮一二区| 国产精品蜜桃在线观看| 我的老师免费观看完整版| 99九九在线精品视频 | 最近最新中文字幕免费大全7| 丰满饥渴人妻一区二区三| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲成人一二三区av| 久久热精品热| 日本欧美国产在线视频| 久久久久久久久久久免费av| 免费观看性生交大片5| 人妻一区二区av| 精品一区在线观看国产| 午夜免费观看性视频| 亚洲精品色激情综合| 免费黄频网站在线观看国产| 精品国产一区二区久久| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美精品一区二区大全| 成人无遮挡网站| 三级经典国产精品| 久久青草综合色| 日本黄色日本黄色录像| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产av一区二区精品久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久久久久久大尺度免费视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 十八禁网站网址无遮挡 | 精品一区二区三卡| 一级毛片 在线播放| 老熟女久久久| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 国产高清国产精品国产三级| 亚洲三级黄色毛片| 大码成人一级视频| av黄色大香蕉| 精品久久久久久电影网| 亚洲美女搞黄在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 在线观看www视频免费| 一区二区三区精品91| 国产视频内射| 国产亚洲5aaaaa淫片| 免费黄色在线免费观看| 久久免费观看电影| 韩国av在线不卡| 日韩av不卡免费在线播放| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品自拍成人| 久久精品久久久久久久性| 日本色播在线视频| 高清在线视频一区二区三区| 精品一区二区免费观看| av在线app专区| 桃花免费在线播放| 乱人伦中国视频| www.色视频.com| 免费少妇av软件| 国产亚洲欧美精品永久| 美女中出高潮动态图| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲av不卡在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 内地一区二区视频在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 国国产精品蜜臀av免费| 久久久欧美国产精品| 久久综合国产亚洲精品| 一个人看视频在线观看www免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲性久久影院| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲久久久国产精品| 日日爽夜夜爽网站| h日本视频在线播放| 午夜91福利影院| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 一区二区三区免费毛片| 99精国产麻豆久久婷婷| 免费观看的影片在线观看|