• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬Gasp1和Gasp2基因?qū)2C12細(xì)胞分化的影響

    2018-05-17 02:42:58樊爽爽張雪梅劉曉賀劉姣揚(yáng)明勝利褚貝貝楊國宇
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒分化試劑盒

    樊爽爽,張雪梅,劉曉賀,劉姣揚(yáng),明勝利,褚貝貝,楊國宇,王 江

    (河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

    在骨骼肌的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中,肌肉生長(zhǎng)抑制素 (Myostatin,MSTN) 是一種重要的細(xì)胞因子,參與肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控[1]。肌肉細(xì)胞分化復(fù)雜過程的順利進(jìn)行是由一組特異的成肌調(diào)控因子、生長(zhǎng)因子、激酶等精確調(diào)控來完成的,這一過程中生肌調(diào)節(jié)因子(MyoD)、肌細(xì)胞生成素(MyoG)、細(xì)胞周期抑制物(P21)、肌球重鏈蛋白(MHC)等基因發(fā)揮著重要作用[2-6]。MyoD蛋白和生肌決定因子(Myf5)是生肌調(diào)節(jié)因子家族(MyoGenic regulatory factors,MRFs)的成員。自Wyzykowski等[7]首次克隆人MyoD基因, 其在促使平滑肌細(xì)胞、原代培養(yǎng)的成軟骨細(xì)胞等骨骼肌細(xì)胞分化中的作用陸續(xù)被證實(shí)[8]。MyoG蛋白為肌細(xì)胞生成素,是轉(zhuǎn)錄因子MyoD家族的成員之一,在MyoD、Myf5下游表達(dá),進(jìn)而終止細(xì)胞增殖,是骨骼肌發(fā)育的正調(diào)控因子,具有調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞融合形成多核肌管的分化標(biāo)志特征[9-11]。P21作為衰老細(xì)胞衍生的抑制蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞衰老過程。在成肌細(xì)胞分化過程中,細(xì)胞周期抑制物P21基因的特征變化是表達(dá)顯著增強(qiáng),提示細(xì)胞不可逆地退出細(xì)胞周期[12]。有研究表明,體外培養(yǎng)細(xì)胞中,MyoD能夠增加MHC報(bào)道基因的表達(dá)[3-6]。Gasp1(Growth and differentiation factor-associated serum protein-1) 蛋白和Gasp2蛋白是卵泡抑素亞家族成員,具有2個(gè)相似的蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域[13]。通過熒光素酶報(bào)告基因分析,Gasp1蛋白被證實(shí)具有抑制成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素生物活性[14]。Gasp1和Gasp2蛋白可以強(qiáng)有力結(jié)合生長(zhǎng)因子TGF1 (Transforming growth factor-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,Bmp2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(Bone morphogenetic protein-4,Bmp4),但是卻并不抑制它們的信號(hào)通路活性[15],同時(shí)還可以阻斷MSTN蛋白等配體的活性,進(jìn)而促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育[16-17]。Gasp1和Gasp2基因雖然在編碼蛋白質(zhì)上高度同源,但在人機(jī)體各個(gè)組織中表達(dá)存在差異,進(jìn)而提示兩者可能具有不同的生物學(xué)功能。此外,許多基于小鼠模型的研究指出,Gasp1基因可以直接但不獨(dú)立地結(jié)合成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素、肌肉生長(zhǎng)抑制素前肽,從而抑制肌肉生長(zhǎng)抑制素活性,促進(jìn)細(xì)胞分化[18-19]。目前,關(guān)于Gasp1和Gasp2在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中參與的分子機(jī)制研究較少,在豬的骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)控中的作用尚不清楚。為此,研究Gasp基因?qū)2C12細(xì)胞分化的影響,為進(jìn)一步選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑 Q5 PCR高保真擴(kuò)增酶、限制性內(nèi)切酶購自NEB公司;DNA切膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;質(zhì)粒中提試劑盒購自QIAGEN公司;Trizol、轉(zhuǎn)染試劑Turbofect購自Thermo公司;高糖DMEM培養(yǎng)基、孕馬血清購自Hyclone公司;胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司;T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、SYBGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、rTaq酶、E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司;嘌呤霉素(Puromycin)購自Sigma公司; phiC31質(zhì)粒購自SBI公司;EB替代物購自上海萊楓生物科技有限公司。

    1.1.2 試驗(yàn)材料 小鼠成肌細(xì)胞(C2C12)、杜長(zhǎng)大三元豬組織為本實(shí)驗(yàn)室保存。采用常規(guī)方法取豬的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、十二指腸、直腸、回腸、肌肉等8種組織,在液氮中速凍,保存于-80 ℃冰箱。

    1.2 方法

    1.2.1 豬組織總RNA的提取及cDNA的合成 用Trizol試劑提取1.1.2中組織的RNA,用微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度和濃度。 以提取的總 RNA 為模板,取1 μg總RNA,使用TakaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,-20 ℃保存。

    1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫檢索得到豬Gasp1和Gasp2基因(GenBank No.:XM_021064627、XM_021083248)的cDNA序列及其相關(guān)信息。根據(jù)豬Gasp1和Gasp2基因的序列采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,克隆引物序列見表1,實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表2。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

    1.2.3Gasp1和Gasp2基因的克隆 以豬肌肉組織cDNA作為模板,用Q5 PCR高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行目的基因Gasp1和Gasp2的擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),然后用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收,回收的PCR產(chǎn)物用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光值,初步確定擴(kuò)增的Gasp1和Gasp2基因的質(zhì)量,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    表1 基因克隆引物

    注:F中下劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn),R中下劃線部分為NheⅠ酶切位點(diǎn)。

    表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

    1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NheⅠ分別對(duì)PCR擴(kuò)增的Gasp1和Gasp2基因以及phiC31載體進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收相應(yīng)大小的目的片段。按T4連接酶說明書進(jìn)行目的片段和phiC31載體的連接,連接體系為:純化的Gasp1和Gasp2基因片段6 μL,雙酶切phiC31載體片段1 μL,T4連接酶1 μL,T4連接酶Buffer 2 μL,體系配制完成后,充分混勻各組分,16 ℃反應(yīng)過夜。第2天將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)100 μg/mL 嘌呤霉素篩選、菌液PCR檢測(cè)和測(cè)序來鑒定陽性重組質(zhì)粒。將測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng),按照QIAGEN試劑盒說明書提質(zhì)粒。

    1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前8 h將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12細(xì)胞以 2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板,待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)75%融合度時(shí),按phiC31、phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2重組質(zhì)粒各2 μg、轉(zhuǎn)染試劑Turbofect 4 μL、DMEM培養(yǎng)基200 μL反應(yīng)體系加入試驗(yàn)組孔中,設(shè)置空白對(duì)照組C2C12、試驗(yàn)組C2C12-phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2及陰性對(duì)照組C2C12-phiC31。6 h左右換液,48 h后加入含有最佳篩選質(zhì)量濃度為4 μg/mL嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),以殺死沒有轉(zhuǎn)染進(jìn)含嘌呤霉素篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞。培養(yǎng)2周后,用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)。

    1.2.6 細(xì)胞增殖速度測(cè)定 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合度時(shí),將試驗(yàn)組C2C12- phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2、陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞,接種到96孔板中。每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)重復(fù),共5 d,以培養(yǎng)基為空白對(duì)照。然后將培養(yǎng)板放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖速率按CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。記錄檢測(cè)的吸光度值,取平均值,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度A值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

    1.2.7 C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 培養(yǎng)C2C12細(xì)胞時(shí),待細(xì)胞融合度達(dá)70%時(shí),將生長(zhǎng)培養(yǎng)基換為含有2%馬血清的分化培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化。每個(gè)試驗(yàn)組分1、2、3、4、5、6 d共6個(gè)時(shí)期,分別在細(xì)胞分化1、2、3、4、5 d時(shí)收集細(xì)胞,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MyoD、MyoG、P21及MHC肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)變化。

    1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肌細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá) 將上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞系C2C12-phiC31、C2C12-phiC31-Gasp1和phiC31-Gasp2接種到6孔板中,待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合度時(shí),按試劑盒說明使用Trizol一步法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將各試驗(yàn)組細(xì)胞cDNA樣品作為反應(yīng)模板進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系為:cDNA 1.25 μL,SYBR MIX 5 μL,上下游引物各0.1 μL,ddH2O 3.55 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率,根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性。以GAPDH為內(nèi)參,以設(shè)置的對(duì)照組mRNA表達(dá)量作為對(duì)照組,對(duì)目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

    1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 熒光定量結(jié)果應(yīng)用MXPro-MX3000P 軟件(Stratagene,美國)進(jìn)行分析處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及熒光曲線的Ct值,采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,并利用GraphPad Prism 5.0軟件和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Gasp1和Gasp2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

    采用Trizol法從豬肌肉組織中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后以肌肉cDNA為模板擴(kuò)增豬Gasp1和Gasp2基因編碼區(qū),經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在1 755 bp和1 659 bp處有特異性條帶出現(xiàn),目的片段大小與預(yù)期結(jié)果相符 (圖1)。

    M:DL2000 DNA Marker;1:Gasp1基因;2:Gasp2基因

    2.2 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

    使用BamHⅠ、NheⅠ限制性內(nèi)切酶分別對(duì)phiC31載體和2.1中PCR回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切,經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收相應(yīng)目的片段。T4連接酶16 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)化,挑選陽性單菌落送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序正確后,擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,用BamHⅠ、NheⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)中提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,獲得phiC31和目的基因相對(duì)應(yīng)的大小片段(圖2)。

    M:DL5000 DNA Marker;1:重組質(zhì)粒phiC31-Gasp1;2:重組質(zhì)粒phiC31-Gasp2

    2.3 Gasp1和Gasp2基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

    待細(xì)胞融合度達(dá)到75%時(shí),將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,用含4 μg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選,篩選2周后,未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的C2C12細(xì)胞死亡,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞大量增殖,在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光充滿視野。結(jié)果表明,成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)C2C12-phiC31、C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2的細(xì)胞系(圖3)。

    A:空白對(duì)照;B:C2C12-phiC31;C:C2C12-phiC31-Gasp1;D:C2C12-phiC31-Gasp2

    2.4 Gasp1和Gasp2基因過表達(dá)對(duì)C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

    在生長(zhǎng)至第2、3天時(shí),細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1 和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力強(qiáng)于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞。而到第5天后,細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力低于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞(圖4)。

    圖4 過表達(dá)Gasp1和Gasp2基因?qū)2C12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

    2.5 Gasp1和Gasp2基因過表達(dá)對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響

    在誘導(dǎo)分化2 d后直到分化末期,穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2的C2C12細(xì)胞的MyoG、MHC、P21基因表達(dá)量相對(duì)于同期對(duì)照組顯著增強(qiáng)。在分化初期MyoD表達(dá)無差異,分化末期穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2的C2C12細(xì)胞MyoD表達(dá)量顯著增強(qiáng)。同時(shí)用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2對(duì)C2C12細(xì)胞分化的促進(jìn)效果顯著 (圖5、6)。

    *表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),下同

    圖6 穩(wěn)定表達(dá)Gasp2對(duì)C2C12細(xì)胞分化的影響

    3 結(jié)論與討論

    肌肉質(zhì)量和功能的改善對(duì)于選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系具有重大的意義[20-21]。卵泡抑素(Follistatin,F(xiàn)ST)作為一種有效的肌肉生長(zhǎng)抑制素拮抗劑,在小鼠中的過表達(dá)可以促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)[16,22]。生長(zhǎng)和分化因子相關(guān)的分泌蛋白Gasp1,含有與蛋白酶抑制性蛋白相關(guān)的多個(gè)結(jié)構(gòu)域,也含有高度保守的半胱氨酸富集序列,稱為卵泡抑素結(jié)構(gòu)域。有研究顯示,F(xiàn)ST相關(guān)基因編碼的蛋白質(zhì)與卵泡抑素高度相似,在體外均可以抑制激活素和多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白[13]。Hill等[14]研究顯示,Gasp1能夠直接且獨(dú)立地與成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制素和肌生長(zhǎng)抑制素前肽結(jié)合,并在體外抑制肌生成抑制素活性。Gasp1和Gasp2蛋白具有54%的同源性,并且在包括骨骼肌在內(nèi)的相似組織中表達(dá)(少數(shù)例外)[23]。與其同源蛋白Gasp2一樣,Gasp1對(duì)調(diào)節(jié)軸骨架中前/后模式的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子(Growth differentination factor 11,GDF11)也有很高的親和力。與Gasp1不同,Gasp2從未被發(fā)現(xiàn)與血清肌肉生長(zhǎng)抑制素相關(guān),盡管它們的相互作用是眾所周知的[24]。本試驗(yàn)利用真核表達(dá)載體phiC31551A過表達(dá),不需要外界化學(xué)能源和蛋白質(zhì)輔助因子、適合大片段基因有效整合,可在多種真核細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮自主作用,并使轉(zhuǎn)基因持續(xù)高效表達(dá),外源基因進(jìn)入細(xì)胞后能夠與細(xì)胞基因組整合進(jìn)而產(chǎn)生永久性表達(dá)[25-26],從而獲得穩(wěn)定表達(dá)Gasp1和Gasp2基因的細(xì)胞株。成肌細(xì)胞的增殖和分化是一個(gè)相互拮抗的過程[27],這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示,豬Gasp1和Gasp2基因在促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化的后期,細(xì)胞C2C12-phiC31-Gasp1和C2C12-phiC31-Gasp2增殖能力低于陰性對(duì)照組C2C12-phiC31細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MyoD、MyoG、P21及MHC分化相關(guān)基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)Gasp1、Gasp2基因可以促進(jìn)肌肉細(xì)胞分化,為進(jìn)一步闡明豬Gasp1、Gasp2基因在肌肉分化中的分子機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)為選育優(yōu)良轉(zhuǎn)基因豬肉新品系奠定了理論基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] Thomas M,Langley B,Berry C,etal.Myostatin,a negative regulator of muscle growth,functions by inhibiting myoblast proliferation [J].J Biol Chem,2000,275(51):40235-40243.

    [2] Buckingham M,Tajbakhsh S.Expression of MyoGenic factors in the mouse:myf-5,the first member of theMyoDgene family to be transcribed during skeletal MyoGenesis [J].C R Acad Sci Ⅲ,1993,316(9):1032-1046.

    [3] Lassar A B,Skapek S X,Novitch B.Regulatory mechanisms that coordinate skeletal muscle differentiation and cell cycle withdrawal [J].Curr Opin Cell Biol,1994,6(6):788-794.

    [4] Miyake M,Hayashi S,Iwasaki S,etal.TIEG1 negatively controls the myoblast pool indispensable for fusion during MyoGenic differentiation of C2C12 cells[J].J Cell Physiol,2011,226(4):1128-1136.

    [5] Muscat G E,Rea S,Downes M.Identification of a regulatory function for an orphan receptor in muscle:COUP-TF Ⅱ affects the expression of theMyoDgene family during MyoGenesis [J].Nucleic Acids Res,1995,23(8):1311-1318.

    [6] Davis R L,Weintraub H,Lassar A B.Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts [J].Cell,1987,51(6):987-1000.

    [7] Wyzykowski J C,Winata T I,Mitin N,etal.Identification of novelMyoDgene targets in proliferating myogenic stem cells [J].Mol Cell Biol,2002,22(17):6199-6208.

    [8] Wright W E,Sassoon D A,Lin V K.MyoGenin,a factor regulating myogenesis,has a domain homologous toMyoD[J].Cell,1989,56(4):607-617.

    [9] Weintraub H,Davis R,Tapscott S,etal.TheMyoDgene family:Nodal point during specification of the muscle cell lineage [J].Science,1991,251(4995):761-766.

    [10] Ott M O,Bober E,Lyons G,etal.Early expression of the myogenic regulatory gene,myf-5,in precursor cells of skeletal muscle in the mouse embryo [J].Development,1991,111(4):1097-1107.

    [11] Gartel A L,Radhakrishnan S K.Lost in transcription:P21 repression,mechanisms,and consequences [J].Cancer Res,2005,65(10):3980-3985.

    [12] Spiller M P,Kambadur R,Jeanplong F,etal.Themyostatingene is a downstream target gene of basic helix-loop-helix transcription factorMyoD[J].Mol Cell Biol,2002,22(20):7066-7082.

    [13] Tsuchida K,Arai K Y,Kuramoto Y,etal.Identification and characterization of a novel follistatin-like protein as a binding protein for the TGF-beta family[J].J Biol Chem,2000,275(52):40788-40796.

    [14] Hill J J,Qiu Y,Hewick R M,etal.Regulation of myostatin in vivo by growth and differentiation factor-associated serum protein-1:A novel protein with protease inhibitor and follistatin domains[J].Mol Endocrinol,2003,17(6):1144-1154.

    [15] Szlama G,Kondas K,Trexler M,etal.WFIKKN1 and WFIKKN2 bind growth factors TGFbeta1,BMP2 and BMP4 but do not inhibit their signalling activity[J].FEBS J,2010,277(24):5040-5050.

    [16] Haidet A M,Rizo L,Handy C,etal.Long-term enhancement of skeletal muscle mass and strength by single gene administration of myostatin inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(11):4318-4322.

    [17] Monestier O,Brun C,Heu K,etal.UbiquitousGasp1 overexpression in mice leads mainly to a hypermuscular phenotype[J].BMC Genomics,2012,13:541.

    [18] Barberi L,Dobrowolny G,Pelosi L,etal.Muscle involvement and IGF-1 signaling in genetic disorders:New therapeutic approaches[J].Endocr Dev,2009,14:29-37.

    [19] Guardiola O,Lafuste P,Brunelli S,etal.Criptoregulates skeletal muscle regeneration and modulates satellite cell determination by antagonizing myostatin[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2012,109(47):3231-3240.

    [20] Minetti G C,Colussi C,Adami R,etal.Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors[J].Nat Med,2006,12:1147-1150.

    [21] Kota J,Handy C R,Haidet A M,etal.Follistatin gene delivery enhances muscle growth and strength in nonhuman primates[J].Sci Transl Med,2009,1:6-15.

    [22] Lee S J,McPherron A C.Regulation of myostatin activity and muscle growth[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:9306-9311.

    [23] Kondás K,Szláma G,Trexler M,etal.Both WFIKKN1 and WFIKKN2 have high affinity for growth and differentiation factors 8 and 11[J].J Biol Chem,2008,283:23677-23684.

    [24] Trexler M,Bányai L,Patthy L.Distinct expression pattern of two related human proteins containing multiple types of protease-inhibitory modules[J].Biol Chem,2002,383:223-228.

    [25] Sarkar A,Sim C,Hong Y S,etal.Molecular evolutionary analysis of the widespread piggy Bac transposon family and related “domesticated” sequences [J].Mol Genet Genom,2003,270(2):173-180.

    [26] Calos M P.The phiC31 integrase system for gene therapy [J].Curr Gene Ther,2006,6(6):633-645.

    [27] Olson E N,Brennan T J,Chakraborty T,etal.Molecular control of myogenesis:Antagonism between growth and differentiation[J].Mol Cell Biochem,1991,104(1/2):7-13.

    猜你喜歡
    質(zhì)粒分化試劑盒
    兩次中美貨幣政策分化的比較及啟示
    分化型甲狀腺癌切除術(shù)后多發(fā)骨轉(zhuǎn)移一例
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對(duì)其增殖的影響
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    Cofilin與分化的研究進(jìn)展
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
    99久久久亚洲精品蜜臀av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 看黄色毛片网站| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 日韩欧美三级三区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲精品在线美女| 亚洲久久久国产精品| 久久精品成人免费网站| 成人18禁在线播放| 黄色成人免费大全| 亚洲,欧美精品.| 麻豆av在线久日| 久久久国产成人精品二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | av免费在线观看网站| 国产男靠女视频免费网站| 99国产精品免费福利视频| 亚洲久久久国产精品| 国产一区二区在线av高清观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 脱女人内裤的视频| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 在线观看舔阴道视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 免费观看人在逋| 亚洲免费av在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久国产精品麻豆| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 99国产精品99久久久久| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲久久久国产精品| 亚洲成av人片免费观看| 91老司机精品| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产精品日韩av在线免费观看 | 91成人精品电影| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 极品人妻少妇av视频| 久久 成人 亚洲| 黄色成人免费大全| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲av成人av| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 无人区码免费观看不卡| 又黄又粗又硬又大视频| 国产高清激情床上av| 大型av网站在线播放| 精品日产1卡2卡| 不卡av一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 啪啪无遮挡十八禁网站| svipshipincom国产片| 成年版毛片免费区| 婷婷六月久久综合丁香| 午夜免费激情av| 制服人妻中文乱码| 在线观看www视频免费| 99热只有精品国产| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 此物有八面人人有两片| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲欧美精品综合久久99| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲国产精品999在线| 日本免费a在线| 性欧美人与动物交配| 搞女人的毛片| 亚洲激情在线av| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美一级毛片孕妇| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久精品成人免费网站| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 性欧美人与动物交配| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美日本中文国产一区发布| 桃色一区二区三区在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一区在线观看完整版| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产激情久久老熟女| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| www.www免费av| 亚洲情色 制服丝袜| 不卡一级毛片| 久久中文字幕一级| 午夜久久久在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 嫩草影视91久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲午夜理论影院| 精品一品国产午夜福利视频| 69精品国产乱码久久久| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲片人在线观看| av福利片在线| 美女国产高潮福利片在线看| 天堂√8在线中文| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 老司机在亚洲福利影院| 在线天堂中文资源库| 黄色片一级片一级黄色片| 91九色精品人成在线观看| 日本欧美视频一区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲,欧美精品.| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 黄色女人牲交| 美女 人体艺术 gogo| 美国免费a级毛片| 啦啦啦免费观看视频1| 一边摸一边抽搐一进一小说| 窝窝影院91人妻| 精品人妻1区二区| 满18在线观看网站| 中文字幕久久专区| 欧美在线黄色| 久久久国产成人免费| 亚洲情色 制服丝袜| 国产乱人伦免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 成人三级黄色视频| 国产三级黄色录像| 久久久久国内视频| 中文字幕色久视频| 国产精品野战在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 最好的美女福利视频网| 长腿黑丝高跟| 人成视频在线观看免费观看| av片东京热男人的天堂| 国产精品久久电影中文字幕| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 少妇粗大呻吟视频| 岛国视频午夜一区免费看| 制服诱惑二区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 在线天堂中文资源库| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 嫩草影视91久久| 人成视频在线观看免费观看| 色播在线永久视频| 国产免费av片在线观看野外av| 国产av又大| 午夜福利影视在线免费观看| 久久精品影院6| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 少妇 在线观看| 国产精品九九99| 欧美一级毛片孕妇| 久久人人97超碰香蕉20202| 两个人视频免费观看高清| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲国产看品久久| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 岛国视频午夜一区免费看| av片东京热男人的天堂| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产亚洲精品久久久久5区| 天堂影院成人在线观看| 免费少妇av软件| 香蕉国产在线看| 一本大道久久a久久精品| 亚洲视频免费观看视频| 很黄的视频免费| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲色图综合在线观看| 丰满的人妻完整版| 极品人妻少妇av视频| av免费在线观看网站| 国产三级黄色录像| 久久人妻av系列| 国产三级在线视频| 欧美乱妇无乱码| 一本大道久久a久久精品| 日韩欧美三级三区| 老司机午夜福利在线观看视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产午夜精品久久久久久| 操出白浆在线播放| 久久青草综合色| 在线观看www视频免费| 一进一出好大好爽视频| 老鸭窝网址在线观看| 国产激情久久老熟女| 成年版毛片免费区| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 狠狠狠狠99中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 精品高清国产在线一区| 999精品在线视频| 免费在线观看完整版高清| 十八禁人妻一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品1区2区在线观看.| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 男女下面插进去视频免费观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲片人在线观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 91字幕亚洲| a级毛片在线看网站| 丝袜美足系列| 久久精品影院6| 亚洲avbb在线观看| 91成人精品电影| 真人一进一出gif抽搐免费| 女性被躁到高潮视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美大码av| 在线视频色国产色| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精华国产精华精| 久久精品国产综合久久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 成熟少妇高潮喷水视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 很黄的视频免费| 日本黄色视频三级网站网址| 一二三四社区在线视频社区8| 精品日产1卡2卡| 丝袜在线中文字幕| 啦啦啦 在线观看视频| av中文乱码字幕在线| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 日韩高清综合在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 成年版毛片免费区| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品野战在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美黑人欧美精品刺激| 99riav亚洲国产免费| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲自拍偷在线| 日韩欧美免费精品| 在线av久久热| 级片在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲少妇的诱惑av| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久精品国产清高在天天线| 国产成人影院久久av| 91老司机精品| ponron亚洲| 亚洲性夜色夜夜综合| 性欧美人与动物交配| 亚洲色图av天堂| 国产一卡二卡三卡精品| 女警被强在线播放| 国产精品亚洲美女久久久| 黄色视频不卡| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产高清激情床上av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 午夜精品国产一区二区电影| 在线观看日韩欧美| 成人av一区二区三区在线看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| av电影中文网址| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 少妇的丰满在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久久国产成人精品二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| xxx96com| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲人成77777在线视频| 中出人妻视频一区二区| 欧美精品亚洲一区二区| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 国产免费男女视频| 一进一出好大好爽视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲av片天天在线观看| 久热这里只有精品99| 后天国语完整版免费观看| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| av片东京热男人的天堂| 91成人精品电影| x7x7x7水蜜桃| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产欧美日韩一区二区精品| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲五月婷婷丁香| 动漫黄色视频在线观看| 午夜精品在线福利| 999精品在线视频| 一区二区三区精品91| 在线观看66精品国产| 69av精品久久久久久| 不卡av一区二区三区| 丝袜美腿诱惑在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 色播在线永久视频| 国产精品av久久久久免费| netflix在线观看网站| 亚洲中文av在线| 99精品在免费线老司机午夜| 免费高清视频大片| 国内精品久久久久精免费| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 日本 av在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产精品999在线| 首页视频小说图片口味搜索| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品亚洲av一区麻豆| 村上凉子中文字幕在线| 国产亚洲欧美98| 男女午夜视频在线观看| 久久久国产成人精品二区| 久久人人精品亚洲av| x7x7x7水蜜桃| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 色av中文字幕| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美在线一区亚洲| 久热爱精品视频在线9| 免费搜索国产男女视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲av熟女| 国产精品亚洲美女久久久| 精品国产乱码久久久久久男人| a级毛片在线看网站| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美不卡视频在线免费观看 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 成年人黄色毛片网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 99久久综合精品五月天人人| 国产欧美日韩一区二区三区在线| av网站免费在线观看视频| 91在线观看av| 99国产精品免费福利视频| 性欧美人与动物交配| 身体一侧抽搐| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产99久久九九免费精品| 在线观看一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品免费视频内射| 午夜免费激情av| 国产午夜福利久久久久久| 后天国语完整版免费观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产麻豆69| 亚洲美女黄片视频| 国产成人啪精品午夜网站| 国产高清激情床上av| 伦理电影免费视频| 99国产精品免费福利视频| 日日爽夜夜爽网站| videosex国产| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 一级a爱视频在线免费观看| 久久久久国内视频| 悠悠久久av| 一进一出抽搐动态| 亚洲欧美日韩无卡精品| 午夜成年电影在线免费观看| 国产一卡二卡三卡精品| 99精品在免费线老司机午夜| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 在线国产一区二区在线| 国产高清有码在线观看视频 | 国产成人av教育| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲国产看品久久| 级片在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 91精品国产国语对白视频| 亚洲无线在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 十分钟在线观看高清视频www| 国产成人系列免费观看| 亚洲第一电影网av| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久精品国产综合久久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国语自产精品视频在线第100页| 十八禁人妻一区二区| 黄色 视频免费看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久国产精品人妻蜜桃| 成人亚洲精品一区在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲五月婷婷丁香| 此物有八面人人有两片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久天堂一区二区三区四区| 日日爽夜夜爽网站| 搡老妇女老女人老熟妇| 美女国产高潮福利片在线看| 日本免费a在线| av电影中文网址| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 久久 成人 亚洲| 亚洲自拍偷在线| 日韩视频一区二区在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 国产av一区二区精品久久| 老司机福利观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 身体一侧抽搐| 一本久久中文字幕| 久热爱精品视频在线9| 国产精品久久久久久人妻精品电影| av电影中文网址| 黑丝袜美女国产一区| 久久国产精品人妻蜜桃| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品日产1卡2卡| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲欧美激情综合另类| 97碰自拍视频| bbb黄色大片| 悠悠久久av| 国产色视频综合| 中文亚洲av片在线观看爽| 操出白浆在线播放| 国产一区在线观看成人免费| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 在线国产一区二区在线| 国产成人精品在线电影| 亚洲最大成人中文| 麻豆av在线久日| 999精品在线视频| 国产区一区二久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日韩欧美国产在线观看| 国产精品,欧美在线| 级片在线观看| 亚洲av电影在线进入| 美国免费a级毛片| 国产精品av久久久久免费| netflix在线观看网站| 老鸭窝网址在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 在线av久久热| 亚洲视频免费观看视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 美女高潮到喷水免费观看| 搞女人的毛片| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产野战对白在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 少妇粗大呻吟视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 91麻豆精品激情在线观看国产| 一区二区三区国产精品乱码| 国产高清有码在线观看视频 | 99精品在免费线老司机午夜| 两个人视频免费观看高清| 不卡一级毛片| 中出人妻视频一区二区| 91精品三级在线观看| 一本综合久久免费| 大香蕉久久成人网| 无遮挡黄片免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久香蕉精品热| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 少妇被粗大的猛进出69影院| 色播在线永久视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲少妇的诱惑av| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美成人一区二区免费高清观看 | 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品免费一区二区三区在线| 91老司机精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 看黄色毛片网站| 啦啦啦免费观看视频1| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 精品午夜福利视频在线观看一区| 他把我摸到了高潮在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 丝袜在线中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 精品国产一区二区三区四区第35| 性少妇av在线| 999精品在线视频| 国产午夜精品久久久久久| 色播在线永久视频| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲欧美激情在线| 两性夫妻黄色片| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲精华国产精华精| 在线观看66精品国产| 久久久久九九精品影院| 成人特级黄色片久久久久久久| 黄片大片在线免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 一区在线观看完整版| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 黄色片一级片一级黄色片| 91成人精品电影| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 两个人看的免费小视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 精品久久久久久久人妻蜜臀av | 亚洲人成电影观看| 999精品在线视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 美女大奶头视频| 多毛熟女@视频| 午夜福利,免费看| 国产精品野战在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 精品久久久精品久久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久国产精品影院| 欧美色视频一区免费| ponron亚洲| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 久久人妻av系列| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美大码av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品电影一区二区在线| www.熟女人妻精品国产| 免费看美女性在线毛片视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 色尼玛亚洲综合影院| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日本三级黄在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成人18禁在线播放| 制服丝袜大香蕉在线| 少妇粗大呻吟视频| 正在播放国产对白刺激| 午夜亚洲福利在线播放| 大型黄色视频在线免费观看| 精品第一国产精品| 大型av网站在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 一级片免费观看大全| 精品人妻1区二区| 中文字幕久久专区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 黄色a级毛片大全视频| 男女下面插进去视频免费观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清 |