白念珠菌酵母相與菌絲相對(duì)5種抗真菌藥物的敏感性比較

厲榮玉 陳京 歐成舉

(皖南醫(yī)學(xué)院1.微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室；2.附屬弋磯山醫(yī)院檢驗(yàn)科，蕪湖 241002)

白念珠菌是最常見(jiàn)的條件致病性真菌，該菌有酵母相和菌絲相兩種細(xì)胞形態(tài)，酵母相幾乎沒(méi)有致病性，而菌絲相的形成在對(duì)宿主的黏附和致病過(guò)程中起重要作用[1]。隨著真菌病治療學(xué)研究的發(fā)展，白念珠菌的耐藥問(wèn)題已成為研究的熱點(diǎn)[2-3]，但以往研究主要針對(duì)的是酵母相，若以菌絲相為研究對(duì)象，能更確切反映其在體內(nèi)真實(shí)情況。因此，為明確這兩相細(xì)胞對(duì)抗真菌藥物的敏感性的差異，指導(dǎo)臨床合理使用抗真菌藥物治療白念珠菌引起的感染，本研究對(duì)近期臨床所分離的220株白念珠菌的酵母相和菌絲相兩相細(xì)胞對(duì)5種常用的抗真菌藥物的敏感性作一比較，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

受試菌株來(lái)自于皖南醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院和第二醫(yī)院住院感染患者的痰液、咽拭子、尿液等標(biāo)本，其中同一患者同樣標(biāo)本多次分離出相同白念珠菌者，按1株計(jì)算。受試菌株共220株?？拐婢幬飪尚悦顾谺 (AmB)、氟康唑 (FCA)、伊曲康唑 (ITR)、伏立康唑 (VRC)、5-氟胞嘧啶 (5-FC)均來(lái)自微量稀釋法藥敏試劑盒ATB FUNGUS 3，購(gòu)于法國(guó)-生物梅里埃公司。

白念珠菌酵母相采用氯霉素沙堡弱培養(yǎng)基，購(gòu)于鄭州博賽生物工程公司；菌絲相采用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；法國(guó)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基 (CHROM agarCandida)購(gòu)于博賽生物工程公司；自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK-32、酵母樣真菌鑒定卡 (YBC)、微量稀釋法藥敏試劑盒ATB FUNGUS 3均為法國(guó)-生物梅里埃公司產(chǎn)品；質(zhì)控菌株近平滑念珠ATCC22019、克柔念珠菌ATCC6258購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 方法

菌株分離鑒定 將各種臨床標(biāo)本先接種于氯霉素沙堡弱培養(yǎng)基，35℃孵育，培養(yǎng)陽(yáng)性者，菌落經(jīng)革蘭染色確認(rèn)為酵母樣菌后，轉(zhuǎn)種至科瑪嘉顯色培養(yǎng)基進(jìn)行初步鑒定，再用VITEK-32的酵母樣真菌鑒定卡 (YBC)進(jìn)行鑒定。

菌絲相的誘導(dǎo) 白念珠菌菌絲相的誘導(dǎo)參照文獻(xiàn)進(jìn)行[4]。將220株白念珠菌分別接種于5 mL含10%小牛血清的RPMI 1640 (pH7.5)培養(yǎng)液中，置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱，36℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)7 d。其中第1～2天每8 h轉(zhuǎn)種1次，第3～5天每12 h轉(zhuǎn)種1次，第6～7天每24 h轉(zhuǎn)種1次，共轉(zhuǎn)種12次。

藥敏試驗(yàn) 采用ATB FUNGUS 3試劑盒，嚴(yán)格按照操作按說(shuō)明進(jìn)行。挑取單個(gè)菌落 (≥1 mm)用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整比濁至2麥?zhǔn)蠁挝?，用微量加樣器?0 μL菌液加入ATB培養(yǎng)基，用自動(dòng)加樣器混勻后依次加入ATB藥敏板，每孔135 μL，蓋上塑料蓋，35℃孵育24 h上機(jī)測(cè)定。結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì) (NCCLS)抗真菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，判定敏感 (S)、中介 (I)、耐藥 (S)3種結(jié)果。FCZ MIC≤8 μg/mL為敏感，16～32 μg/mL為中介，≥64 μg/mL為耐藥；ITR MIC≤0.125 μg/mL為敏感，0.25～0.5 μg/mL為中介，≥1.0 μg/mL為耐藥；VRC MIC≤1 μg/mL為敏感，MIC=2 μg/mL為中介，≥4 μg/mL為耐藥；5-FC MIC≤4 μg/mL為敏感，8～16 μg/mL中介，≥32 μg/mL為耐藥。AMB尚未定義，根據(jù)說(shuō)明書(shū)，MIC≤1 μg/mL為敏感，≥2 μg/mL為耐藥。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 白念珠菌菌絲相培養(yǎng)結(jié)果

白念珠菌在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中連續(xù)傳代7 d后，其菌絲相形成率達(dá)99%以上，見(jiàn)圖1～2。

圖1白念珠菌菌絲相細(xì)胞 (革蘭染色，×1 000)圖2白念珠菌菌絲相細(xì)胞 (革蘭染色，×400)

Fig.1Candidaalbicanscells of hyphal form (Graman staining，×1 000)Fig.2Candidaalbicanscells of hyphal form (Graman staining，×400)

2.2 藥敏結(jié)果

220株白念珠菌酵母相與菌絲相對(duì)5種抗真菌藥物的敏感率及MIC值 220株受試菌株對(duì)兩性霉素B和5-氟胞嘧啶較為敏感，酵母相和菌絲相對(duì)兩性霉素B敏感率分別為97.27%、97.73%，耐藥率分別為2.73%、2.27%；對(duì)5-氟胞嘧啶敏感率分別為96.82%、97.27%，耐藥率均為2.27%。3種唑類(lèi)藥物中，對(duì)氟康唑的敏感率最低，敏感率分別為81.82%、85%，耐藥率分別為14.54%、11.36%；其次是伊曲康唑，對(duì)伊曲康唑的敏感率分別為87.27%、90.46%，耐藥率分別為9.09%、6.36%；對(duì)伏立康唑的敏感率最高，分別為92.72%、95%，耐藥率分別為3.64%、2.27%。

5種抗真菌藥物中，氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑?qū)Π啄钪榫湍赶郙IC值顯著高于菌絲相 (P<0.05)，而兩性霉素對(duì)白念珠菌酵母相和菌絲相MIC值差異不顯著 (P>0.05)。

220株白念珠菌酵母相與菌絲相對(duì)5種抗真菌藥物的敏感率及MIC值見(jiàn)表1。

表1 220株白念珠菌酵母相與菌絲相對(duì)5種抗真菌藥物的敏感率及MIC值

注：*.α=0.05水平上差異顯著

白念珠菌酵母相與菌絲相敏感性的差異 220株白念珠菌兩相細(xì)胞對(duì)5種抗真菌藥物的敏感度總體一致性為85.46% (188/220)，220株受試菌株中共有32株白念珠菌酵母相與菌絲相對(duì)5種抗真菌藥物表現(xiàn)出不同的敏感性。

兩性霉素B有1株酵母相為耐藥株，但菌絲相卻為敏感株。氟康唑有4株酵母相為耐藥株，但菌絲相卻為中介株；有3株酵母相為耐藥株，但菌絲相卻為敏感株；有4株酵母相為中介株，但菌絲相卻為敏感株。伊曲康唑有4株酵母相為耐藥株，但菌絲相卻為中介株；有2株酵母相為耐藥株，但菌絲相卻為敏感株；有5株酵母相為中介株，但菌絲相卻為敏感株。伏立康唑有3株酵母相為耐藥株，但菌絲相卻為中介株；有5株酵母相為中介株，但菌絲相卻為敏感株。5-氟胞嘧啶有1株酵母相為中介株，但菌絲相卻為敏感株。白念珠菌酵母相與菌絲相敏感性的差異見(jiàn)表2。

3 討 論

本研究中報(bào)道的受試菌株無(wú)論是酵母相還是菌絲相的敏感率與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者的報(bào)道均有一定差異[5-7]，敏感率多低于以往報(bào)道，這可能與菌株的來(lái)源及各醫(yī)院抗真菌藥物的使用和地區(qū)等不同原因有關(guān)。

關(guān)于白念珠菌酵母相與菌絲相藥物敏感性差異的比較，有些學(xué)者認(rèn)為白念珠菌酵母相與菌絲相對(duì)抗真菌藥物的敏感性不同，某些抗真菌藥物對(duì)菌絲相的抗菌活性強(qiáng)于酵母相[8-10]。本研究中表1顯示，220株受試白念珠菌菌絲相對(duì)5種抗真菌藥物的敏感率均要高于酵母相，其中酵母相與菌絲相對(duì)氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的敏感性存在顯著差異 (P<0.05)，而對(duì)兩性霉素差異不顯著 (P>0.05)。這表明白念珠菌細(xì)胞形態(tài)對(duì)這3種藥物的敏感性具有重要的影響，即氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑?qū)Π啄钪榫z相的作用大干對(duì)酵母相。表2顯示，同一菌株在酵母相和菌絲相兩種不同的形態(tài)下對(duì)同一種藥物的敏感性可能有差異，有些菌株酵母相處于耐藥或中介水平，但菌絲相卻是中介或敏感，說(shuō)明酵母相和菌絲相的相位改變會(huì)影響其敏感性。以上研究結(jié)果表明菌絲相較酵母相對(duì)抗真菌藥物更加敏感，抗真菌藥物對(duì)菌絲相作用更強(qiáng)大，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[8-10]。

表232株白念珠菌酵母相與菌絲相對(duì)5種抗真菌藥物敏感性差異的比較

Tab.2The susceptibilities difference of yeast-form and hyphal-form of 32Candidastrains to 5 antifungal agents

抗真菌藥物敏感性差異(酵母相→菌絲相)R→I(株數(shù))R→S(株數(shù))I→S(株數(shù))合計(jì)(株數(shù))兩性霉素B11氟康唑43411伊曲康唑42511伏立康唑3585?氟胞嘧啶11合計(jì)1161532

白念珠菌酵母相與菌絲相兩相細(xì)胞對(duì)抗菌藥物的敏感性差異產(chǎn)生的原因，可能是由于形成酵母相與菌絲相的結(jié)構(gòu)成分不同，因此對(duì)抗菌藥物的敏感性也不同。唑類(lèi)藥物的作用機(jī)制是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制真菌羊毛甾醇14α-脫甲基酶，干擾細(xì)胞膜麥角固醇的合成，造成固醇前體的積累和麥角固醇的耗盡，導(dǎo)致質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能的改變，抑制真菌細(xì)胞的生長(zhǎng)；兩性霉素B是多烯類(lèi)抗真菌藥物，主要作用于真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇，使麥角固醇不能合成，并產(chǎn)生小孔，細(xì)胞因電解質(zhì)和基質(zhì)外泄而死亡[11]。白念珠菌酵母相與菌絲相細(xì)胞形態(tài)不同，兩相細(xì)胞對(duì)麥角固醇的需求量也不同。由此推測(cè)，唑類(lèi)藥物及兩性霉素B對(duì)白念珠菌酵母相與菌絲相抗菌活性的差異，可能是由于酵母相與菌絲相對(duì)麥角固醇需求量不同所造成。5-氟胞嘧啶為抑菌劑，屬于嘧啶類(lèi)抗真菌藥物，它進(jìn)入敏感真菌后，在細(xì)胞內(nèi)胞嘧啶脫氨基酶和尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)化為5-氟鳥(niǎo)苷酸，干擾或抑制真菌蛋白質(zhì)或氨基酸的合成，發(fā)揮抑菌作用[11]。由此推測(cè)，5-氟胞嘧啶對(duì)白念珠菌酵母相與菌絲相抗菌活性的差異，可能是由于兩相細(xì)胞中胞嘧啶脫氨基酶和尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶含量不同所造成。

綜上所述，白念珠菌酵母相與菌絲相對(duì)抗菌藥物的敏感性存在差異。由于菌絲相是白念珠菌對(duì)人體的主要致病形式，因此，在體外對(duì)白念珠菌進(jìn)行病原真菌學(xué)研究時(shí)，選用其菌絲相更有意義，更能反映體內(nèi)真實(shí)情況。

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