SakA對馬爾尼菲籃狀菌藥物應(yīng)激及致病力的影響

寧心強 魏金瑛 鄭艷青 梁浩 曹存巍

(1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021；2.廣西艾滋病防治研究重點實驗室，南寧 530021；3.柳州市中醫(yī)院，柳州 545001；4.廣西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院&生命科學研究院，南寧 530021)

馬爾尼菲籃狀菌 (Talaromycesmarneffei, TM)，原名馬爾尼菲青霉菌 (Penicilliummarnef-fei)是溫度依賴性雙相真菌，在我國廣西、廣東以及東南亞呈區(qū)域性流行[1-2]，主要感染免疫低下人群，特別是HIV患者，若得不到有效治療，病死率極高[3-4]。TM首先侵犯單核吞噬系統(tǒng)。在巨噬細胞內(nèi)，TM面對溫度、滲透壓的急劇變化及活性氧的殺傷，如何適應(yīng)并有效定植對研究其致病性極為關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，高滲透性甘油促絲裂原活化蛋白激酶通路 (Hog1-MAPK)，參與多種真菌的滲透壓、氧化應(yīng)激以及形態(tài)轉(zhuǎn)換等，是影響真菌致病力的因素之一[5-7]。HOG1基因在絲狀真菌構(gòu)巢曲霉等稱為SakA(stress-activated kinase)。在對TM的研究發(fā)現(xiàn)，SakA(Hog1)在抵御熱應(yīng)激、滲透壓及氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用[8-10]，但目前對該基因在小鼠致病和藥物壓力的作用研究尚未見報道。因此，我們通過巨噬細胞共培養(yǎng)及感染小鼠模型，探討SakA在TM侵襲性感染中的作用，比較SakA敲除株和野生株在藥物壓力下的生長情況，探討SakA在酵母相對棘白霉素不敏感的機制，為闡明TM的致病性提供生物學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗菌株

T.marneffei2株，1株是由墨爾本大學Alex Andronopolous教授惠贈的野生株FRR2161；另1株是SakA敲除株 (ΔsakA)，由原生質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化技術(shù)敲除SakA基因獲得，具體方法見文獻[11]。菌株均經(jīng)過TM雙相性及形態(tài)學或分子生物學鑒定，敲除株經(jīng)Southern blot驗證。藥敏實驗選近平滑念珠菌ATCC22019作為質(zhì)控株，由北京大學真菌研究中心惠贈。

1.2 實驗細胞

小鼠巨噬細胞株RAW264.7由廣西醫(yī)科大學藥理學院惠贈。

1.3 抗真菌藥物

卡泊芬凈 (CPFG)，米卡芬凈 (MCFG)，伊曲康唑 (ITC)，伏立康唑 (VOC)，氟康唑 (FLC)和兩性霉素B (AmB)。以上藥物全為原粉，均購于美國sigma公司，其純度≥99%。

2 實驗方法

2.1 菌株活化及菌懸液制備

將FRR和ΔsakA分別接種于SDA培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7 d。各實驗菌株在ANM (A.nidulans minimal)培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)種3次，每次鏡下觀察菌絲形態(tài)。挑取適量菌落置于預(yù)裝有3 mL滅菌用水的50 mL離心管中，震蕩后靜置10 min，吸取上清，過濾去除菌絲，用細胞計數(shù)板計算孢子懸液濃度，根據(jù)實驗方案用滅菌用水調(diào)整孢子濃度。

2.2 巨噬細胞共培養(yǎng)

準備6孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種細胞104cell，每孔加入105孢子 (FRR/ΔsakA)，孢子加入前預(yù)先予鈣熒光白染色10 min，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察巨噬細胞內(nèi)孢子形態(tài)。另準備6孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種細胞105cell，每孔加入106孢子 (FRR/ΔsakA)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)2 h，PBS洗去未被吞噬的孢子，繼續(xù)共培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，冷PBS裂解細胞，裂解物按1∶100稀釋后取100 μL于YPD培養(yǎng)皿涂板，25℃培養(yǎng)72 h后計算菌落數(shù)。空白對照組不加孢子。

2.3 FKS1和CHS基因的表達

挑取適量菌體分別在25℃和37℃恒溫培養(yǎng)搖床震蕩培養(yǎng)72 h后，過濾培養(yǎng)液，收集菌絲。采用Trizol法提取真菌RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR)測定1,3-β-D葡聚糖和幾丁質(zhì)的編碼基因 (FKS1和CHS)表達，benA(beta-tubulin gene)為內(nèi)參基因。引物序列、反應(yīng)體系和條件參照Suwunnakorn S所做的研究[12]。利用擴增循環(huán)數(shù) (Threshold Cycle, Ct )計算FKS1和CHS基因相對表達量。計算公式：△Ct= Ct目的基因-Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct實驗組-△Ct對照組，相對表達量=2^(-△△Ct)。兩組間基因表達差異運用獨立樣本t檢驗分析。

2.4 藥物敏感實驗

制備菌液及藥物儲存液 菌懸液調(diào)整至 (1～5)×106CFU/mL，用RPMI 1640稀釋成 (1～5)×104CFU/mL的兩倍終濃度的菌懸液。用滅菌水將氟康唑、卡泊芬凈、米卡芬配制成1 280 mg/L；用DMSO將兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑配成1 600 mg/L，儲存?zhèn)溆?，實驗前根?jù)需要用RPMI 1640稀釋。

藥敏板配制 在96孔細胞培養(yǎng)板上，從第1列到第10列每孔加入藥物稀釋液100 μL，各藥物濃度范圍：CPFG及MCFG為0.25～32 μg/mL，F(xiàn)LC 0.125～64 μg/mL，ITC 0.03～16 μg/mL，AmB 0.125～16 μg/mL，VOC 0.03～16 μg/mL。取100 μL RPMI 1640 (不含藥液)加入第11列作為生長對照，取200 μL RPMI 1640 (不含藥液)加入第12列作為陰性對照。配制好的藥敏板存-20℃?zhèn)溆谩?/p>

液體培養(yǎng)基接種 除第12列陰性對照，余各孔均加入100 μL菌液，25℃及37℃下培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。每次使用質(zhì)控菌株進行質(zhì)控。

結(jié)果判定 MIC值參照美國臨床實驗室標準化委員會推薦的M38-A2方案[13-14]，卡泊芬凈、米卡芬凈、氟康唑與生長對照孔相比，≥80%生長抑制所對應(yīng)的最低藥物濃度；伊曲康唑、伏立康唑和兩性霉素B為100%生長抑制所對應(yīng)的最低藥物濃度。重復(fù)3次實驗。

2.5 感染動物模型

實驗材料 Balb/c小鼠，雌雄不限，體重 (20±2) g，購于廣西醫(yī)科大學動物中心；將孢子懸液調(diào)整至107/mL和109/mL，分別用于菌載量組和死亡率組的注射。

實驗分組 小鼠隨機分3組：菌載量組 (每只接種孢子量106)9只；死亡率組 (每只接種孢子量108/只)9只 ；對照組9只。每只小鼠實驗前4 d，前1天和實驗當天按200 mg/kg腹腔注射環(huán)磷酰胺 (濃度20 mg/mL)，實驗當天按40 mg/kg腹腔注射曲安奈德 (8 mg/mL)。實驗當天：載菌量組每只小鼠腹腔注射孢子量106，死亡率組每只小鼠腹腔注射孢子量108。對照組注射0.1 mL生理鹽水。

觀察指標 一般情況：進食、活動、反應(yīng)、體重、被毛。菌載量組，感染第3、6、9天分別無菌解剖3只，收集肝脾肺，稱重，加1 mL滅菌水研磨，收集研磨液倍比稀釋10倍、100倍、1 000倍，取100 μL于YPD平皿涂板，25℃培養(yǎng)72 h計算菌落數(shù)。所得菌落數(shù)取平均值乘以稀釋倍數(shù)，再除以組織重量，得出每只小鼠的組織菌載量。重復(fù)實驗3次。死亡率組，每天記錄小鼠死亡的天數(shù)及只數(shù)，觀察周期為14 d，使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

3 結(jié) 果

3.1 菌株特征

FRR和ΔsakA在ANM培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7 d后，顯微鏡下觀察 (見圖1～2)，F(xiàn)RR細樹枝狀，以帚狀枝方式產(chǎn)孢，分生孢子梗見豐富孢子；ΔsakA菌絲彎曲不規(guī)則，多數(shù)細胞異常腫脹，甚至溶解破裂，分生孢子形態(tài)畸變。鈣熒光白染色后 (見圖3)，F(xiàn)RR細胞壁幾丁質(zhì)分布均勻，而ΔsakA細胞壁染色不均，幾丁質(zhì)異常沉積。

3.2 巨噬細胞共培養(yǎng)

FRR在巨噬細胞內(nèi)可見大量臘腸狀酵母細胞；ΔsakA在巨噬細胞內(nèi)以孢子形態(tài)存在，不能轉(zhuǎn)化成酵母細胞 (見圖4)。共培養(yǎng)裂解物在YPD培養(yǎng)皿上25℃，72 h生長情況：空白對照組無真菌生長，F(xiàn)RR組及ΔsakA組可見菌落形成 (見圖5)，且FRR組>ΔsakA組 (P<0.05)。與FRR相比，ΔsakA更易被巨噬細胞殺死 (見表1)。

圖125℃下，F(xiàn)RR與ΔsakA在ANM培養(yǎng)基下生長7 d的產(chǎn)孢情況 (×40)圖225℃下，F(xiàn)RR與ΔsakA在ANM培養(yǎng)基下生長7 d的菌絲形態(tài) (×40)圖325℃下，F(xiàn)RR與ΔsakA在ANM培養(yǎng)基下生長7 d，鈣熒光白染色后細胞壁幾丁質(zhì)的分布情況 (×400，紅色箭頭指示幾丁質(zhì)沉積位置)圖4FRR和ΔsakA分別與小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)24 h熒光顯微鏡下形態(tài) (×400)圖525℃ 72 h，TM不同菌株在YPD上菌落形態(tài)

Fig.1Conidial germination ofFRRandΔsakAstrains on A.nidulans minimal medium at 25℃ for 7 daysFig.2Hyphal morphogenesis ofΔsakAcompared withFRRstrains on A.nidulans minimal medium at 25℃ for 7 daysFig.3FRRandΔsakAstrains were grown for 7 days at 25℃ on ANM and stained with calcofluor white (CAL) to visualize cell walls and septaFig.4FRRandΔsakAwere co-cultured with mouse macrophages for 24 h under fluorescence microscope, respectivelyFig.5Colony morphology of different strains of TM on YPD at 25℃ for 72 h

表1CFU檢測SakA對小鼠巨噬細胞吞噬TM分生孢子的影響 (X±Sn=3)

Tab.1Effect ofSakAon phagocytic conidia of macrophages detected by CFU (X±Sn=3)

組別CFU(103)Control0．00±0．00FRR42．89±4．80?ΔsakA11．67±2．06?#

注：*.P<0.01 vs control；#.P<0.05 vsΔsakA

3.3 細胞壁合成基因的表達

野生株FKS1、CHS基因mRNA表達量在37℃酵母相較25℃菌絲相明顯升高 (P<0.05)(見圖6)，提示TM轉(zhuǎn)化為酵母相后細胞壁成分發(fā)生變化，1,3-β-D葡聚糖和幾丁質(zhì)含量增加，這可能是TM酵母相對棘白霉素敏感性較菌絲相下降的原因。ΔsakA和FRR的基因表達顯示 (見圖7)：25℃菌絲相下，二者FKS1、CHS基因表達水平無差異 (P>0.05)，而37℃酵母相時ΔsakA的FKS1、CHS基因表達水與FRR相比均明顯下降 (P<0.05)。

3.4 藥物敏感試驗

敲除株和野生株一樣，兩相形態(tài)對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的敏感性都無差異。與野生株酵母相相比，敲除株酵母相對兩性霉素B、卡泊芬凈及米卡芬凈MIC減小1～2個濃度梯度 (見表2)。

表2六種抗真菌藥對野生株和敲除株體外藥敏結(jié)果

Tab.2Invitrosusceptibility of six antifungal drugs to wild strains and knockout strains

藥物名稱FRRMIC(μg/mL)ΔsakAMIC(μg/mL)菌絲相酵母相菌絲相酵母相兩性霉素B0．50．50．50．12氟康唑8844伊曲康唑0．030．030．010．01伏立康唑0．060．060．030．03卡泊芬凈21628米卡芬凈43248

3.5 感染小鼠模型

野生株感染小鼠14 d內(nèi)死亡率為100%，且感染短期內(nèi)多出現(xiàn)逆毛、體重下降、進食減少、活動力下降且反應(yīng)遲鈍，而敲除株感染小鼠少有上述癥狀，14 d內(nèi)死亡率僅33.3% (見圖8)。菌載量實驗中，涂板后ΔsakA組絕大部分未見菌落生長，與FRR組相比有明顯差異 (見圖9)。

4 討 論

SakA(Hog1)-MAPK信號通路參與多種真菌的滲透壓應(yīng)激、氧化應(yīng)激反應(yīng)，以及形態(tài)轉(zhuǎn)換、呼吸代謝等。煙曲霉SakA-MAPK信號通路在感受氧化壓力的刺激以及外源性滲透壓變化并產(chǎn)生適應(yīng)性應(yīng)答發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。白念珠菌Hog1-MAPK通路至少涉及三種過程：對外界壓力的反應(yīng)和適應(yīng)、形態(tài)轉(zhuǎn)換、胞壁合成，且該通路涉及多種組氨酸激酶的調(diào)控[16-17]。在馬爾尼菲籃狀菌中HOG1的同源基因為SakA[9]，研究表明，SakA在馬爾尼菲籃狀菌環(huán)境應(yīng)激包括高熱、滲透壓以及氧化應(yīng)激中發(fā)揮著重要作用[8-10]。我們的前期工作也發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，ΔsakA在37℃及39℃下生長速度明顯減慢；發(fā)芽率較野生株低，產(chǎn)孢困難；在高滲、氧化應(yīng)激下生長受抑制，進一步證實了SakA在TM抵御環(huán)境應(yīng)激的重要意義。在此基礎(chǔ)上，本研究探索SakA在TM藥物應(yīng)激以及對小鼠致病力的影響。

在本課題組前期的體外藥敏研究中發(fā)現(xiàn)，TM的雙相形態(tài)對棘白霉素類抗真菌藥的敏感性存在較大差異。菌絲相TM對米卡芬凈敏感，而在37℃轉(zhuǎn)化為致病的酵母樣形態(tài)后對米卡芬凈敏感性明顯降低[18]。棘白霉素類藥物作用于真菌細胞壁，通過抑制β-1,3-葡聚糖合成酶復(fù)合體活性，從而減少真菌細胞壁主要成分β-1,3-葡聚糖的合成而發(fā)揮抗真菌的作用[19]。以往認為真菌對棘白霉素藥敏感性降低的主要原因是獲得性或固有性的FKS基因突變[20-22]。但在TM的研究中發(fā)現(xiàn)，TM的菌絲及酵母相的FKS基因序列無改變，但存在該基因mRNA及蛋白質(zhì)表達水平的明顯差異；同時TM轉(zhuǎn)化為酵母相后細胞壁幾丁質(zhì)合成酶編碼基因CHS表達明顯升高[23-24]。因此，我們推測，TM從菌絲相轉(zhuǎn)化為酵母相后，F(xiàn)KS1基因無突變，但該基因及幾丁質(zhì)合成的編碼基因CHS表達量發(fā)生了變化以及由此引起的細胞壁成分變化，可能參與了TM酵母相對棘白霉素類藥物不敏感的發(fā)生。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，SakA可調(diào)控細胞壁FKS、CHS基因的表達，ΔsakA敲除株FKS1、CHS表達量低于野生株FRR。在體外藥敏試驗中，ΔsakA敲除株的酵母相對卡泊芬凈、米卡芬凈的敏感性較野生株明顯升高。由此提示，SakA信號通路在TM酵母相應(yīng)對棘白霉素的殺傷時，通過調(diào)控TM細胞壁合成編碼基因，引起細胞壁成分改變，從而導(dǎo)致TM酵母相對棘白霉素類藥物敏感性降低。

圖6在25℃及37℃下，野生株FKS1和CHS基因的表達水平 (P<0.05)圖725℃、37℃下，F(xiàn)RR和ΔsakA的FKS1和CHS基因表達水平 (25℃下，兩者基因表達差異P>0.05；37℃，兩者基因表達差異P<0.05)圖8FRR和ΔsakA分別感染小鼠14 d后的生存曲線 (P<0.05)圖9FRR和ΔsakA分別感染小鼠6 d后的內(nèi)臟 (肝、脾、肺)菌載量

Fig.6Expression levels ofCHSandFKS1 at both 25℃ and 37℃ inFRRFig.7Expression levels ofCHSandFKS1 at both 25℃ and 37℃ in each strainsFig.8Survival curves of mice infected withFRRandΔsakAfor 14 days respectively (P<0.05)Fig.9The visceral (liver, spleen, lung) fungal load of mice infected withFRRandΔsakArespectively after 6 days

對多種真菌病原體的研究中發(fā)現(xiàn)，SakA(Hog1)是真菌重要的毒力因子[25-30]。在我們建立的TM與小鼠巨噬細胞共培養(yǎng)實驗以及TM感染動物模型中，與野生株相比，SakA基因敲除后在小鼠巨噬細胞內(nèi)不能轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍赶?，抵御巨噬細胞殺傷的能力明顯減弱；同時在感染小鼠的各個臟器中SakA敲除株繁殖能力明顯減弱，致病力顯著下降。提示SakA在TM抵御宿主免疫細胞殺傷，侵襲感染中發(fā)揮重要作用，是TM重要的毒力因子。

綜上所述，馬爾尼菲籃狀菌SakA-MAPK信號通路關(guān)鍵基因SakA在馬爾尼菲籃狀菌抵御環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，并參與調(diào)控細胞壁成分變化，與其酵母相對棘白霉素類藥物不敏感相關(guān)。此外，SakA是TM重要的毒力因子，在對小鼠致病過程中發(fā)揮重要的作用。SakA-MAPK信號通路上其他基因是否與SakA基因協(xié)同參與馬爾尼菲籃狀菌抵抗外界應(yīng)激反應(yīng)，有待進一步的研究開展。

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