大腸癌組織miR-143-3p表達(dá)變化與患者臨床病理參數(shù)和多藥耐藥的關(guān)系

杜夢(mèng)楠，嚴(yán)曉麗，袁亞男，黃艷潔，鄭紀(jì)寧

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德067000)

根治性手術(shù)后輔以化療是目前大腸癌的主要治療手段，多藥耐藥(MDR)是導(dǎo)致化療效果不佳的主要原因。MDR的發(fā)生可能涉及多種基因的改變，目前研究最多的是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中多藥耐藥蛋白1(MDR1)。MDR1的編碼蛋白P-糖蛋白(P-gp)是一種ATP能量依賴性藥物輸出泵，可將細(xì)胞內(nèi)藥物泵至細(xì)胞外，從而降低藥物在細(xì)胞內(nèi)蓄積，導(dǎo)致化療效果降低[1，2]。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約為20個(gè)核苷酸序列的非編碼小分子RNA，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，具有調(diào)控基因表達(dá)功能。miRNA作為內(nèi)源性小分子RNA幾乎在所有腫瘤組織中異常表達(dá)。miR-143位于人類第5號(hào)染色體上，根據(jù)剪切具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體部位不同，可加工成miR-143-3p和miR-143-5p，目前的研究多集中在miR-143-5p上。研究證實(shí)，miR-143-5p可調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期等，在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，如前列腺癌[3]。但關(guān)于大腸癌組織miR-143-3p表達(dá)變化及其與患者臨床病理參數(shù)和MDR的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究觀察了大腸癌組織miR-143-3p表達(dá)變化，現(xiàn)分析其表達(dá)變化與患者臨床病理參數(shù)和MDR的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年6月～2017年3月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行大腸癌根治術(shù)的大腸癌患者50例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡>18歲；②首次行大腸癌根治術(shù)，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；③KPS評(píng)分>70分，預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月；④無重要臟器嚴(yán)重疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非原發(fā)性大腸癌；②存在其他部位腫瘤；③術(shù)前接受抗腫瘤治療；④臨床病理資料不完整。其中，男32例、女18例，年齡24～73歲、中位年齡56歲；腫瘤部位：結(jié)腸27例，直腸23例；腫瘤形態(tài)：潰瘍型24例，隆起型26例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期34例；組織分化程度：高中分化33例，低未分化17例；腫瘤浸潤(rùn)深度：未浸透漿膜層20例，浸透漿膜層30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意。

1.2 miR-143-3p、MDR1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。將手術(shù)切除的大腸癌組織50例份及其配對(duì)的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)30例份，液氮中保存?zhèn)溆?。取部分大腸癌組織及癌旁正常組織，置于經(jīng)DEPC水處理的勻漿器中，加入1 mL TRIzol冰上充分勻漿，常規(guī)提取組織總RNA，經(jīng)NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280為1.9～2.1，說明提取的總RNA純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取總RNA 2 μg，按照tiangen miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：MDR1 上游引物 5′-GGAGCCTACTTGGTGGCACATAA-3′，下游引物5′-TGGCATAGTCAGGAGCAA-ATGAA-3-3′；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCA-GT-3′；miR-143-3p莖環(huán)引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAGC-TA-3′，上游引物5′-CGAGAGTGAGATGCACTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGCGAGG-3′；U6莖環(huán)引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-GCACTGGATACGACAAAATA-3′，上游引物5′-AGA-GAAGATTAGCATGGACCCTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。熒光定量PCR采用SYBR Green法，試劑盒為北京天根生化科技有限公司的 SuperReal PreMix Plus。反應(yīng)體系共20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)miR-143-3p mRNA表達(dá)時(shí)，以U6為內(nèi)參；檢測(cè)MDR1 mRNA表達(dá)時(shí)，以GAPDH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。分析大腸癌組織miR-143-3p mRNA表達(dá)與MDR1 mRNA表達(dá)的關(guān)系，以及大腸癌組織miR-143-3p、MDR1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌組織與癌旁正常組織miR-143-3p、MDR1 mRNA表達(dá)比較 大腸癌組織與癌旁正常組織miR-143-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.36±0.22、1.48±0.43，MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為5.84±0.26、1.09±0.38，二者比較P均<0.05。

2.2 大腸癌組織miR-143-3p mRNA表達(dá)與MDR1 mRNA表達(dá)的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，大腸癌組織miR-143-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量與MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.467，P<0.01)。

2.3 大腸癌組織miR-143-3p、MDR1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

3 討論

腫瘤MDR是指一種藥物作用于腫瘤使之產(chǎn)生耐藥性后，該腫瘤對(duì)未接觸過、結(jié)構(gòu)無關(guān)、機(jī)制各異的多種抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性[4]。目前關(guān)于大腸癌MDR的機(jī)制尚不清楚。

表1 大腸癌組織miR-143-3p、MDR1 mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

miRNA是一類非編碼小分子RNA，目前已發(fā)現(xiàn)2 000多種，在已發(fā)現(xiàn)的人類miRNA中，約50%與腫瘤有關(guān)[5]。成熟的miRNA可通過與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)結(jié)合形成RISC復(fù)合物，后者可特異性識(shí)別靶mRNA的3′非編碼區(qū)，從而引起靶mRNA降解、翻譯抑制等，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，如miR-31、miR-126、miR-552等[6，7]；miR-143在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)，如大腸癌、乳腺癌、前列腺癌等[8]；miR-143能促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，在口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能具有抑癌基因作用[9]；miR-143可能通過激活caspase-3、caspase-8、caspase-9下調(diào)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶、核因子κB和bcl-2表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。也有研究認(rèn)為，miR-143可能直接作用于kras、elk1、myo6等與腫瘤發(fā)病相關(guān)的基因[11]。馮麗萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-143通過靶向作用于EGFR/RAS/MAPK信號(hào)通路，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移，同時(shí)增加對(duì)多烯紫杉醇的敏感性。以上研究說明，miR-143可能作為抑癌基因參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展。miR-143有miR-143-3p、miR-143-5p兩種形式，目前的研究多集中在miR-143-5p上，對(duì)miR-143-3p的研究相對(duì)較少。

MDR1的編碼蛋白P-gp是目前研究最多的、與MDR相關(guān)的蛋白。P-gp是ABC家族中的一種跨膜糖蛋白，分子量約為170 kD，可通過ATP的水解獲得能量，將化療藥物泵出細(xì)胞外，從而使患者產(chǎn)生耐藥性，繼而降低化療效果[13，14]。有研究顯示，下調(diào)miR-27a表達(dá)能顯著降低MDR1表達(dá)，降低細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的轉(zhuǎn)錄活性，上調(diào)P21表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖并逆轉(zhuǎn)化療耐藥[15]。Wu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-129-5p通過直接抑制MDR相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞MDR產(chǎn)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-200c通過下調(diào)P-gp或通過抑制JNK通路來抑制腫瘤MDR[17]。但目前對(duì)miR-143-3p表達(dá)與大腸癌MDR的關(guān)系尚不清楚。

本研究結(jié)果顯示，大腸癌組織miR-143-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織；相關(guān)分析顯示，大腸癌組織miR-143-3p mRNA相對(duì)表達(dá)量與MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；大腸癌組織miR-143-3p mRNA表達(dá)與腫瘤TNM分期、組織分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而MDR1 mRNA表達(dá)與腫瘤組織分化程度、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。表明miR-143-3p可參與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展，并與MDR有關(guān)。但由于本研究樣本量較少，且僅從組織水平進(jìn)行驗(yàn)證，其結(jié)論準(zhǔn)確性有待于進(jìn)一步證實(shí)，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量并從細(xì)胞水平上進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，大腸癌組織miR-143-3p低表達(dá)，其表達(dá)變化與腫瘤進(jìn)展及MDR有關(guān)。目前miRNA與大腸癌MDR的研究尚處于起步階段，其具體機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Johnson WW. P-glycoprotein-mediated efflux as a major factor in he variance of absorption and distribution of drugs:modulation of chemotherapy resistance[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2002,24(8):501-514.

[2] Sui H, Fan ZZ, Li Q. Signal transduction pathways and transcriptional mechanisms of ABCB1/Pgp-mediated multiple drug resistance in human cancer cells[J]. J Int Med Res, 2012,40(2):426-435.

[3] Xu B, Niu X, Zhang X, et al. miR-143 decreases prostate cancer cells proliferation and migration and enhances their sensitivity to docetaxel through suppression of KRAS[J]. Mol Cell Biochem, 2011,350(1-2):207-213.

[4] Ford JM, Hait WN. Pharmacology of drugs that alert multidrug resistance in cancer[J]. Phamacol Rev, 1990,42(3):155-199.

[5] Jaganjac M, Poljak-Blazi M, Schaur RJ, et al. Elevated neutrophil elastase and acrolein-protein adducts are associated with W256 regression[J]. Clin Exp Immunol, 2012,170(2):178-185.

[6] Oberg AL, French AJ, Sarver AL, et al. miRNA expression in colon polyps provides evidence for a multihit model of colon cancer[J]. PLoS One, 2011,6(6):e20465.

[7] Bostjancic E, Bandelj B, Luzar B, et al. Hepatic expression of miR-122, miR-126, miR-136 and miR-181a and their correlation to histopathological and clinical characteristics of patients with hepatitis C[J]. J Viral Hepat, 2015,22(2):146-157.

[8] 張曉云，王立峰.miR-143在結(jié)腸癌組織中的差異表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡和遷移的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2017，37(3)：325-329.

[9] He Z, Yi J, Liu X, et al. MiR-143-3p functions as a tumor suppressor by regulating cell proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition by targeting QKI-5 in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Cancer, 2016,15(1):51-56.

[10] Deftereos G, Corrie SR, Feng Q, et al. Expression of mir-21 and mir-143 in cervical specimens ranging from histologically normal through to invasive cervical cancer[J]. PLoS One, 2011,6(12):e28423.

[11] Sin TK, Wang F, Meng F, et al. Implications of microRNAs in the treatment of gefitinib-resistant non-small cell lung cancer[J]. Int J Mol Sci, 2016,17(2):237-242.

[12] 馮麗萍，蘇文媚，鮮楓，等.miR-143/145基因簇調(diào)控小細(xì)胞肺癌耐藥性的研究[J].腫瘤防治研究，2016，43(5)：326-330.

[13] 陳銳，王展，黃壽獎(jiǎng).Nampt在胃癌組織中表達(dá)的臨床意義及其與P-gp和Top-Ⅱα的相關(guān)性[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2016，24(3)：431-436.

[14] 嚴(yán)曉麗，杜夢(mèng)楠，鄭紀(jì)寧.大腸癌石蠟包埋組織中miR-21表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2017，57(10)：11-14.

[15] 蔡穎，徐玲，張曄.MicroRNA調(diào)控胃癌多藥耐藥的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25(14)：2334-2336.

[16] Wu Q, Yang Z, Xia L, et al. Methylation of miR-129-5p CpG island dulates multi-drug resistance in gastric cancer by targeting ABC transporters[J]. Oncotarget, 2014,5(22):11552-11563.

[17] Sui H, Cai GX, Pan SF, et al. miR200c attenuate P-gp-mediated MDR and metastasis by targetingJNK2/c-Jun signaling pathway incolorectal cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2014,13(12):3137-3151.