異煙肼致肝細(xì)胞損傷過(guò)程中組蛋白乙?；瘜?duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用

李金鳳，杜瑩，李標(biāo)，張一楊，李瑩淑，韓鐵生，任琦，馮福民

(華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北唐山063000)

異煙肼(INH)是WHO推薦的一線抗結(jié)核藥物，在抗結(jié)核治療中具有不可替代的作用[1，2]，但長(zhǎng)期服用可導(dǎo)致藥物性肝損傷。流行病學(xué)調(diào)查表明，長(zhǎng)期服用INH的結(jié)核患者轉(zhuǎn)氨酶升高發(fā)生率為10%～20%[3]，其中1%～3%患者可出現(xiàn)嚴(yán)重肝損傷，已成為抗結(jié)核治療終止的重要原因之一[4]。肝細(xì)胞損傷后，打破了細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；负徒M蛋白去乙酰化酶的動(dòng)態(tài)平衡，干擾了染色質(zhì)重塑，造成炎性因子(如IL-6)、氧化應(yīng)激指標(biāo)(如活性氧)等基因異常表達(dá)[5，6]。當(dāng)受損的肝細(xì)胞持續(xù)受到INH刺激時(shí)，大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)[7]。有研究表明，組蛋白乙酰化酶P300可特異性結(jié)合在葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)基因啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控其下游ERS相關(guān)基因表達(dá)，繼而參與細(xì)胞周期調(diào)控[8]；非酒精性脂肪肝中組蛋白去乙?；窰DAC1水平變化可影響CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)的表達(dá)，引起慢性ERS，擾亂肝細(xì)胞脂質(zhì)平衡，誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性[9，10]。目前在INH致肝細(xì)胞損傷過(guò)程中組蛋白乙?；cERS是否有關(guān)尚不清楚。C646為P300的抑制劑，可通過(guò)降低P300表達(dá)參與細(xì)胞的各種生命活動(dòng)[11]；MS-275可通過(guò)抑制HDAC1降低組蛋白乙?；剑c基因轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)[12]。因此推測(cè)，組蛋白乙酰化可能通過(guò)調(diào)控ERS參與INH致肝細(xì)胞損傷。2017年1～5月，我們?cè)贗NH致肝細(xì)胞損傷模型中分別給予C646或MS-275干預(yù)，觀察了組蛋白乙酰化對(duì)ERS的調(diào)控作用，以期為INH致肝細(xì)胞損傷的預(yù)防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常肝細(xì)胞株HL-7702(以下稱HL-7702細(xì)胞)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海分院。INH，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；C646，美國(guó)Cayman Chemical公司；MS-275，瑞士J&K Scientific Ltd公司。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Heraeus集團(tuán)；PCR基因擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；熒光定量RCR儀，美國(guó)Applied Biosystems公司。二甲基亞砜，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；RPMI 1640，美國(guó)Corning cellgro公司；ALT、AST檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；TRIzol，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒，中國(guó)北京冬歌偉業(yè)科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HL-7702細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液5～7 mL分裝于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天換液1次，待培養(yǎng)瓶底鋪滿單層細(xì)胞時(shí)，按1∶2比例進(jìn)行傳代。取傳5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 肝細(xì)胞損傷模型制備及鑒定 參照本課題組前期研究方法制備肝細(xì)胞損傷模型[13]。取傳5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于含RPMI 1640培養(yǎng)液的6孔板，每孔2×105個(gè)，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，隨機(jī)將細(xì)胞分為觀察組、對(duì)照組，觀察組更換為含INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液，對(duì)照組更換為新的RPMI 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000×g離心5 min，留取上清液。采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清ALT、AST活性。根據(jù)ALT、AST檢測(cè)試劑盒說(shuō)明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALT、AST活性。結(jié)果顯示，觀察組培養(yǎng)液上清ALT活性為(4.31±0.40)IU/L，AST活性為(5.87±0.54)IU/L，對(duì)照組分別為(1.44±0.32)、(4.73±0.59)IU/L。觀察組培養(yǎng)液上清ALT、AST活性均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。表明觀察組已經(jīng)出現(xiàn)肝細(xì)胞損傷。

1.4 細(xì)胞分組處理 取傳5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于含2 mL RPMI 1640培養(yǎng)液的6孔板，每孔2×105個(gè)，37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，隨機(jī)將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、INH組、C646組、INH+C646組、MS-275組和INH+MS-275組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組更換為2 mL新的RPMI 1640培養(yǎng)液；INH組更換為2 mL含INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液；C646組更換為2 mL含C646 5 μmol/L的RPMI 1640培養(yǎng)液；INH+C646組更換為2 mL含C646 5 μmol/L和INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液；MS-275組更換為2 mL含MS-275 5 μmol/L的RPMI 1640培養(yǎng)液；INH+MS-275組更換為含MS-275 5 μmol/L和INH 1 000 μg/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液。各組繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.5 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.5.1 肝細(xì)胞P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA表達(dá) 采用Real-time PCR法。收集各組處理3 h細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)260、280 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，A260/A280為1.8～2.0，表明提取的總RNA純度合格。取總RNA 2 μL，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 1 min。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。P300上游引物：5′-AGAAGATGAAGCGGGTTGTG-3′，下游引物：5′-CAGTTGGTGTCGTTGGAGTG-3′；HDAC1上游引物：5′-GGCATCTGGCTTCTGTTACG-3′，下游引物：5′-CTCGTCATCAATCCCGTCTC-3′；GRP78上游引物：5′-GCACAGACGGGTCATTCCAC-3′，下游引物：5′-TCCTATGTCGCCTTCACTCC-3′；CHOP上游引物：5′-CAGAACCAGCAGAGGTCACA-3′，下游引物：5′-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3′；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，下游引物：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：ROX Reference Dye 0.4 μL，SYBR Premix Ex Taq 10 μL，DEPC水6.8 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，取平均值。

1.5.2 肝細(xì)胞P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量 采用ELISA法。收集各組處理3 h細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000×g離心5 min，留取培養(yǎng)液上清。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 各組P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

2.2 各組培養(yǎng)液上清P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量比較 見(jiàn)表2。

表1 各組P300、HDAC1、GRP78、CHOP mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與INH組比較，#P<0.05。

表2 各組培養(yǎng)液上清P300、HDAC1、GRP78、CHOP蛋白含量比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與INH組比較，#P<0.05。

3 討論

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的、嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病。據(jù)WHO報(bào)道，近年來(lái)結(jié)核病“死灰復(fù)燃”，與艾滋病、瘧疾一起成為三大傳染病。我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，WHO推薦的一線抗結(jié)核藥物INH、利福平、吡嗪酰胺等均對(duì)肝臟有不同程度毒性作用，聯(lián)合用藥時(shí)肝損害更嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生慢性肝炎、肝纖維化甚至肝衰竭等，常常迫使抗結(jié)核治療中斷，繼而患者病情加重，同時(shí)亦使結(jié)核桿菌耐藥風(fēng)險(xiǎn)增加?？菇Y(jié)核藥物性肝損傷由抗結(jié)核藥物代謝終產(chǎn)物在體內(nèi)蓄積引起，破壞了細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡，繼而產(chǎn)生肝損傷，其嚴(yán)重程度因個(gè)體差異而不同，目前尚難預(yù)測(cè)。因此，探討抗結(jié)核藥物性肝損傷中的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

INH在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝，在肝細(xì)胞中經(jīng)過(guò)乙酰轉(zhuǎn)移酶2和細(xì)胞色素P450酶系催化，大部分代謝產(chǎn)物經(jīng)腎臟排出體外，但小部分代謝產(chǎn)物可在體內(nèi)殘留、蓄積，并可直接與肝細(xì)胞內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，改變細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；?，進(jìn)而誘發(fā)肝細(xì)胞損傷。組蛋白乙?；怯山M蛋白乙酰化酶P300和組蛋白去乙?；窰DAC1共同調(diào)控，可通過(guò)調(diào)控IL-2等轉(zhuǎn)錄因子活性，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NF-κB等炎性因子表達(dá)，繼而參與酒精性脂肪肝、肝纖維化等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展[14]。P300可結(jié)合到組蛋白N端富含賴氨酸殘基的尾部，促進(jìn)染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活，啟動(dòng)組蛋白乙酰化作用，而HDAC1可使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，抑制基因轉(zhuǎn)錄，使組蛋白去乙?；?，二者可相互拮抗。有研究報(bào)道，INH能通過(guò)影響P300和HDAC1的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)改變細(xì)胞中組蛋白乙?；癄顟B(tài)，從而導(dǎo)致大鼠肝細(xì)胞損傷[15]。本研究通過(guò)INH處理HL-7702細(xì)胞制備肝細(xì)胞損傷模型，結(jié)果顯示，觀察組培養(yǎng)液上清ALT、AST含量明顯高于對(duì)照組，證實(shí)INH處理可致肝細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，INH組P300 mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯降低，HDAC1 mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯增加，證實(shí)組蛋白乙?；瘏⑴cINH致肝細(xì)胞損傷過(guò)程，與本課題組前期研究[15]結(jié)果一致。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核生物細(xì)胞中與分泌相關(guān)的重要細(xì)胞器，可參與蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、折疊和修飾。當(dāng)外源性或內(nèi)源性物質(zhì)刺激細(xì)胞時(shí)，大量未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)堆積，影響細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)ERS。GRP78表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞存活，而促凋亡分子CHOP表達(dá)增加則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，二者作為ERS的標(biāo)志性分子，在ERS過(guò)程中具有重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，ERS與非酒精性脂肪肝、肝硬化等肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[16～19]。槲皮素可升高CHOP mRNA和蛋白表達(dá)，激活ERS信號(hào)通路，誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡[20]；糖尿病大鼠經(jīng)鏈唑霉素處理后，肝組織GRP78蛋白表達(dá)明顯升高，未折疊蛋白反應(yīng)作為ERS的保護(hù)性反應(yīng)，其信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[21]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，INH組GRP78、CHOP mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯升高，說(shuō)明ERS參與INH致肝細(xì)胞損傷過(guò)程。但組蛋白乙酰化是否參與調(diào)控ERS，繼而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷尚不清楚。

研究報(bào)道，在大鼠心肌缺血再灌注損傷中，曲古霉素A可上調(diào)ERS相關(guān)蛋白GRP78啟動(dòng)子處組蛋白H4乙?；絒22]；丙戊酸可通過(guò)抑制HDAC活性提高GRP78蛋白表達(dá)和整體組蛋白H3的乙酰化水平，抑制CHOP上調(diào)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶表達(dá)，減輕ERS誘導(dǎo)的糖尿病腎病細(xì)胞凋亡[23]。組蛋白乙?；纱龠M(jìn)CFTR基因表達(dá)，誘發(fā)ERS，促進(jìn)高同型半胱氨酸所致?lián)p傷肝細(xì)胞的凋亡[24]。上述研究表明，組蛋白乙?；稍谝欢ǔ潭壬险{(diào)控ERS，但其調(diào)控ERS參與肝臟疾病的報(bào)道鮮見(jiàn)。組蛋白乙?；敢种苿〤646對(duì)P300具有高度選擇性，可通過(guò)結(jié)合到P300的Lys-CoA結(jié)構(gòu)區(qū)對(duì)其功能產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制；而組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275能顯著抑制HDAC1活性，增加細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；潭?。為進(jìn)一步研究INH致肝細(xì)胞損傷中組蛋白乙?；瘜?duì)ERS的調(diào)控作用，我們?cè)谥苽涓渭?xì)胞損傷模型同時(shí)分別加入C646或MS-275干預(yù)，結(jié)果顯示，與INH組比較，INH+C646組中P300 mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯降低，說(shuō)明其組蛋白乙?；浇档停鳨RS標(biāo)志性分子GRP78 mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯下降，CHOP mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯升高，說(shuō)明肝細(xì)胞損傷加重；與INH組比較，INH+MS-275組HDAC1 mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯降低，說(shuō)明組蛋白乙?；缴?，GRP78 mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯升高，CHOP mRNA表達(dá)和蛋白含量均明顯降低，說(shuō)明ERS得到緩解，肝細(xì)胞損傷減輕。由此可見(jiàn)，在INH致肝細(xì)胞損傷過(guò)程中，C646和MS-275均可通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；癄顟B(tài)參與調(diào)控ERS，進(jìn)而影響肝細(xì)胞損傷的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，組蛋白乙酰化通過(guò)調(diào)控ERS參與INH致肝細(xì)胞損傷。但組蛋白乙?；瘏⑴cERS的具體作用機(jī)制尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步研究。

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