紅霉素對煙草煙霧刺激下人巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的抑制作用及其機(jī)制

邱居烽，李梅華，鐘小寧，文明智，馬南，唐曉娟，黃梅，梁權(quán)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種具有氣流受限特征的肺部疾病，其發(fā)病機(jī)制與免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激、蛋白酶與抗蛋白酶失衡等有關(guān)[1]。吸煙可通過多種途徑參與COPD的發(fā)生。研究證實，煙草煙霧吸入可誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng)，在此過程中巨噬細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-8、IL-6等，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞募集、浸潤和激活，繼而引起氣道結(jié)構(gòu)破壞[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，長期小劑量應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(如紅霉素)可通過抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生而抑制氣道炎癥反應(yīng)[3,4]。2016年6月～2017年5月，本研究觀察了紅霉素對煙草煙霧提取物(CSE)刺激下人巨噬細(xì)胞TNF-α釋放的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討紅霉素抑制氣道炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人類單核細(xì)胞株U937(以下稱U937細(xì)胞)，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。真龍牌過濾型香煙(焦油量15 mg，煙堿量1.2 mg)，廣西卷煙總廠。紅霉素、曲古霉素A(TSA)、佛波酯，美國Sigma公司。ELx800全自動酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；DYY-7C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；5813R高速離心機(jī)，艾本德中國有限公司；E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α ELISA檢測試劑盒，美國R&D Systems公司；全蛋白提取試劑盒，美國Pierce公司；兔抗組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)多克隆抗體、兔抗NF-κB多克隆抗體，美國Santa Cruz公司；山羊抗兔IgG，美國Pierce公司。

1.2 CSE溶液制備 CSE溶液制備參照Mercado等[5]的方法：實驗前1 h，將2支點燃的去過濾嘴香煙連于一抽吸驅(qū)動裝置，反復(fù)緩慢抽吸，使其煙霧通過10 mL RPMI 1640培養(yǎng)液中制成CSE懸液，調(diào)整懸液pH值至7.4，在超凈臺中經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾，即為CSE原液。用RPMI 1640培養(yǎng)液將CSE原液濃度稀釋至10%備用。

1.3 紅霉素、CSE溶液抑制巨噬細(xì)胞增殖活性的最佳作用濃度和作用時間篩選 將U937細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天傳代。取傳2代對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔板，每孔(0.5～1)×104個，然后加入200 ng/mL佛波酯溶液10 μL，誘導(dǎo)分化24 h即可分化為巨噬細(xì)胞[6]。將分化的巨噬細(xì)胞分為兩部分，一部分分別加入使細(xì)胞干預(yù)終濃度為0.1、1、10 μg/mL紅霉素溶液[7]，另一部分分別加入使細(xì)胞干預(yù)終濃度為0.1%、1%、2.5% CSE溶液，兩部分均設(shè)置陰性對照孔，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔；分別于孵育24、48、72 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入DMSO 150 μL，振蕩混勻。酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各孔的光密度(OD)值。以O(shè)D450值代表細(xì)胞增殖活性。結(jié)果見表1、2。結(jié)果顯示，2.5% CSE溶液作用24、48、72 h均能明顯抑制巨噬細(xì)胞增殖活性(P均<0.05)，而0.1、1、10 μg/mL紅霉素溶液和0.1%、1% CSE溶液對巨噬細(xì)胞增殖活性影響不大(P均>0.05)。為使CSE和紅霉素作用于U937細(xì)胞時盡可能發(fā)揮各自作用，又不影響細(xì)胞增殖活性，故選用干預(yù)終濃度為1 μg/mL紅霉素溶液和1% CSE溶液、作用時間24 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1 不同濃度紅霉素溶液作用24、48、72 h巨噬細(xì)胞增殖活性比較

注：不同濃度紅霉素溶液細(xì)胞增殖活性兩兩比較，P均>0.05。

1.4 細(xì)胞分組處理 取傳2代對數(shù)生長期U937細(xì)胞，接種于含10% FBS RPMI 1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶(0.5～0.6)×107個，按1.3中的方法誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，并隨機(jī)分為空白對照組、CSE組、紅霉素+CSE組、TSA組?？瞻讓φ战M不予處理；CSE組加入1% CSE溶液孵育24 h；紅霉素+CSE組先加入1 μg/mL紅霉素溶液預(yù)孵育24 h，再加入1% CSE溶液孵育24 h；TSA組加入100 ng/mL TSA孵育24 h。

表2 不同濃度CSE溶液作用24、48、72 h巨噬細(xì)胞增殖活性比較

注：與陰性對照同期比較，*P<0.05；與0.1% CSE溶液同期比較，#P<0.05；與1% CSE溶液同期比較，△P<0.05；與同濃度作用48 h比較，▲P<0.05；與同濃度作用72 h比較，▽P<0.05。

1.5 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.5.1 培養(yǎng)液上清TNF-α含量 各組細(xì)胞孵育結(jié)束，收集培養(yǎng)液，4 000×g離心20 min，留取培養(yǎng)液上清。按ELISA試劑盒說明配置標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔每孔加入100 μL待測樣品，標(biāo)準(zhǔn)品孔每孔加入100 μL倍比稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃溫育2 h；每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100 μL，37 ℃溫育 1 h；棄去孔內(nèi)液體，洗板3次，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素工作液，37 ℃溫育1 h；棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，每孔加入90 μL底物溶液，37 ℃避光顯色30 min，再加入50 μL終止液終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀450 nm波長處檢測各組OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組培養(yǎng)液上清TNF-α含量。

1.5.2 細(xì)胞HDAC1、NF-κB蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。各組細(xì)胞孵育結(jié)束，用預(yù)冷的PBS清洗3次，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。取細(xì)胞總蛋白按4∶1比例加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性，- 80 ℃保存。取變性蛋白50 μg行SDS-PAGE，90 V恒壓2 h，200 mA恒流70 min；電泳結(jié)束，將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，TBST洗膜5 min×5次，用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h；TBST洗膜5 min×5次，分別加入含HDAC1(1∶1 000)或NF-κB(1∶1 000)或β-actin(1∶1 000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜；次日TBST洗膜5 min×5次，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)，常溫孵育1 h；TBST清洗，暗室中顯影、定影。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析各蛋白電泳條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組培養(yǎng)液上清TNF-α含量比較 空白對照組培養(yǎng)液上清TNF-α含量為(274.96±182.39)pg/mL，CSE組為(744.46±638.38)pg/mL，紅霉素+CSE組為(646.57±603.53)pg/mL。組間兩兩比較P均<0.05。

2.2 各組HDAC1、NF-κB蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組HDAC1、NF-κB蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與CSE組比較，#P<0.05；與紅霉素+CSE組比較，△P<0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者痰中巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，并且能夠通過分泌細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等參與炎癥應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)，與COPD的發(fā)病息息相關(guān)[2，8]。煙草煙霧能夠直接激活巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，如IL-8、TNF-α、CCL2等，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥細(xì)胞募集和激活，引起炎癥狀態(tài)持續(xù)和組織損傷[9]。既往研究表明，煙草煙霧通過激活巨噬細(xì)胞的核因子轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(如NF-κB)，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放[10]，從而誘導(dǎo)炎癥。TNF-α作為重要的促炎因子參與炎癥反應(yīng)中炎癥細(xì)胞和炎癥因子的聚集、釋放等，與炎癥的維持和發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，煙草煙霧能刺激人巨噬細(xì)胞TNF-α釋放增加[11]。而TNF-α的釋放是由轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，已有研究證實，TNF-α釋放與NF-κB密切相關(guān)，通過鈣蛋白酶抑制劑抑制IκBα活性，可減少NF-κB表達(dá)，降低NF-κB依賴的炎癥因子TNF-α釋放[12～14]。

組蛋白去乙?；?HDACs)包括4個組18個亞型，其中Ⅰ型(HDAC1、2、3、8)已被證實在炎癥反應(yīng)中具有重要作用，其與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)作用相反[15]。HATs相關(guān)乙?；饔檬沟萌旧|(zhì)解螺旋至轉(zhuǎn)錄因子和相應(yīng)RNA聚合酶結(jié)合到DNA上促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活，HDACs則通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)作用增加組蛋白去乙?；M(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄，抑制炎癥應(yīng)答[15，16]。HDAC1是HDACs的重要亞型，可通過乙?；饔靡种芅F-κB表達(dá)和激活，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程中至關(guān)重要[17]。

臨床研究證實，紅霉素可作為抗炎和免疫調(diào)節(jié)劑用于治療慢性肺部疾病，如COPD、彌漫性泛細(xì)支氣管炎、支氣管哮喘等。紅霉素可通過增加HDACs表達(dá)及活性，抑制炎癥基因轉(zhuǎn)錄，減少促炎細(xì)胞因子生成和白細(xì)胞黏附，加速中性粒細(xì)胞死亡和清除，在減輕COPD氣道炎癥反應(yīng)中具有重要作用[7，18]。

本研究觀察了紅霉素對巨噬細(xì)胞TNF-α釋放及其對HDAC1、NF-κB蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，CSE組和紅霉素+CSE組培養(yǎng)液上清TNF-α含量明顯增加；而紅霉素+CSE組培養(yǎng)液上清TNF-α含量較CSE組明顯降低。提示煙草煙霧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是通過促使巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)TNF-α增加導(dǎo)致的，而紅霉素能降低巨噬細(xì)胞TNF-α釋放進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，CSE組、紅霉素+CSE組NF-κB蛋白表達(dá)升高，HDAC1蛋白表達(dá)降低，提示煙草煙霧刺激可能通過抑制HDAC1蛋白表達(dá)、激活NF-κB信號通路，繼而引起炎癥應(yīng)答。TSA是HDAC的特異性抑制劑，本研究以TSA作為陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSE組與TSA組HDAC1蛋白表達(dá)均降低，NF-κB蛋白表達(dá)均升高，進(jìn)一步驗證了上述結(jié)論。本研究還發(fā)現(xiàn)，與CSE組比較，紅霉素+CSE組NF-κB蛋白表達(dá)降低，HDAC1蛋白表達(dá)上升，提示紅霉素能夠通過恢復(fù)HDAC1蛋白表達(dá)及降低NF-κB蛋白表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。研究證實，煙草煙霧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過程是通過抑制巨噬細(xì)胞HDAC1蛋白表達(dá)，激活NF-κB信號通路，進(jìn)而引起TNF-α釋放增加而實現(xiàn)的；紅霉素干預(yù)可使巨噬細(xì)胞HDAC1蛋白表達(dá)上調(diào)，抑制NF-κB蛋白表達(dá)，NF-κB依賴的TNF-α釋放減少，繼而減輕炎癥反應(yīng)。我們推測這可能是紅霉素減輕煙草煙霧刺激誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制之一。

綜上所述，紅霉素能抑制煙草煙霧刺激下巨噬細(xì)胞TNF-α釋放增多，其作用機(jī)制可能是通過恢復(fù)受煙草煙霧抑制的HDAC1蛋白表達(dá)，抑制NF-κB蛋白表達(dá)，使NF-κB依賴的TNF-α釋放減少，繼而減輕炎癥反應(yīng)。本研究為紅霉素用于治療慢性氣道炎癥性疾病提供了實驗依據(jù)。

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