苜蓿葉蛋白酶解物抗氧化活性研究

王宇

摘要：以苜蓿葉蛋白粉為原料，利用堿性蛋白酶水解制備寡肽。研究了不同水解度（DH）的苜蓿葉蛋白酶解物抗氧化活性。結(jié)果表明：水解度分別為15. 42%、17. 28%、19. 35%、21. 60%、22. 32%、22. 78%的苜蓿葉蛋白寡肽溶液對(duì)二苯代苦味肼基自由基（DPPH）清除能力隨水解度的增大呈現(xiàn)先逐漸上升后下降的趨勢(shì)，在酶解物濃度為2 mg/mL時(shí)，水解度為21. 60%時(shí)，苜蓿寡肽對(duì)DPPH清除作用最強(qiáng)為85. 78%。

關(guān)鍵詞：苜蓿葉蛋白；堿性蛋白酶；水解度；抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-9737（2018）08-0003-02

紫花苜蓿為豆科苜蓿屬多年生草本植物。苜蓿葉產(chǎn)量高，葉蛋白中粗蛋白質(zhì)含量為32%～65%，且蛋白質(zhì)的氨基酸種類(lèi)齊全、組成合理，屬優(yōu)質(zhì)蛋白。但大多提取后的植物葉蛋白由于溶解度較低，很難添加在乳品、飲料、糖果等食品體系中加以利用。而且植物蛋白具有一定的抗原性，其消化率和生物效價(jià)遠(yuǎn)不及牛奶、雞蛋等動(dòng)物蛋白[1]，這些都限制了植物葉蛋白的利用。通過(guò)用酸、堿或酶法對(duì)葉蛋白改性，降低蛋白分子的相對(duì)質(zhì)量，對(duì)于提高其溶解性、起泡性、乳化性等功能特性、改善其口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都具有十分重要意義。大量研究表明，蛋白質(zhì)水解物多具有較好的抗氧化活性，可作為天然的抗氧化劑使用[2]。有試驗(yàn)證明苜蓿葉蛋白具有很好的生理保健功能[3]，如選擇適當(dāng)?shù)牡鞍酌阁w外水解苜蓿葉蛋白，就有可能釋放出有活性的肽段，制備出具有特定生理功能的活性肽。因此選用來(lái)源豐富的苜蓿葉蛋白為原料研究開(kāi)發(fā)葉蛋白酶解物具有重大意義。本研究采用堿性蛋白酶對(duì)苜蓿葉蛋白進(jìn)行不同條件的水解，得到不同水解度的苜蓿葉蛋白酶解物，測(cè)定其抗氧化活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用苜蓿葉蛋白提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

苜蓿葉蛋白（蛋白質(zhì)含量78. 23%）堿提酸沉法制備；堿性蛋白酶（ Protamex）上海源葉生物科技有限公司，酶活力10萬(wàn)u/g；二苯代苦味肼基自由基（DPPH -） Sigma公司，無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸等，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，分析純。

設(shè)備包括DS-1高速組織搗碎機(jī)，上海標(biāo)本模型制造廠；80 1臺(tái)式低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS- 25（數(shù)顯）pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FD -1真空冷凍干燥機(jī)、SHZ- 82水浴恒溫振蕩器，金壇市億能試驗(yàn)儀器廠；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿性蛋白酶水解苜蓿葉蛋白制備寡肽工藝

將一定濃度的苜蓿葉蛋白溶液，置于溫度為50℃水浴中預(yù)熱處理30 min。處理后調(diào)節(jié)至堿性蛋白酶適宜的反應(yīng)溫度和pH值。隨著水解反應(yīng)的進(jìn)行，酶解液的pH值逐漸下降，滴加1.0 mol/L NaOH溶液保持蛋白酶最適pH值不變，記錄消耗NaOH溶液用量。100℃沸水中滅酶保持10 min。取出迅速冷卻，4000 r/min離心20 min，取上清液，冷凍干燥，計(jì)算不同酶解條件的蛋白質(zhì)水解度。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了兩個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)：

配制底物濃度為5%的苜蓿葉蛋白溶液，將pH值分別控制在7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.O，溫度為50℃，酶添加量1000 u/g，水解3h，滅酶，離心取上清液凍干。計(jì)算其水解度。

配制底物濃度為5%的苜蓿葉蛋白溶液，將溫度分別控制在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，pH值為8.5，酶添加量1000 u/g，水解3h，滅酶，離心取上清液凍干。計(jì)算其水解度。

1.2.2 對(duì)二苯代苦味肼基自由基清除能力的測(cè)定

研究不同水解度的苜蓿葉蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH 清除能力的影響，初步確定水解度與抗氧化活性的關(guān)系。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 水解度的測(cè)定采用pH-Stat法[4]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用微量凱氏定氮法[5]。

1.3.3 二苯代苦味肼基自由基（ DPPH-）清除能力的測(cè)定：

參考Shimadac6]的方法略作改動(dòng)。各取2 mL待測(cè)樣品溶液（質(zhì)量濃度為0—2.5 mg/mL），依次與2.0 mL濃度為0. 04 g/L的DPPH 無(wú)水乙醇溶液室溫避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)i。另取2 mL待測(cè)樣品與2 mL無(wú)水乙醇避光反應(yīng)20 min，在517 nm處測(cè)吸光值A(chǔ)j；以2 mLO.04 g/L DPPH 無(wú)水乙醇溶液和2 mL無(wú)水乙醇反應(yīng)作為參比，其吸光值為A0。可以按照下列公式計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)DPPH 的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶水解苜蓿葉蛋白制備寡肽

在兩個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)中，本論文選擇了水解度有一定差異的6個(gè)苜蓿葉蛋白酶解物。其酶解條件及水解度結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 不同水解度酶解產(chǎn)物的抗氧化活性的研究

堿性蛋白酶作用于苜蓿葉蛋白不同時(shí)間而得到的酶解產(chǎn)物的肽鏈結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度不同，其活性可能不同。通常期望得到的是具有特定功能的分子量較小的寡肽，若單純追求高水解度指標(biāo)，雖然產(chǎn)生較多的游離氨基酸，但疏水性氨基酸含量可能不多，其活性不一定高，因此本論文研究不同酶解物的抗氧化活性，以探討水解度與抗氧化活性之間的關(guān)系。

大多數(shù)自由基反應(yīng)活性較強(qiáng)而壽命短暫，DPPH 即使在室溫條件下也能保持穩(wěn)定，用DPPH 清除能力反映被測(cè)物的抗氧化活性操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏。因此本研究考察了不同DH的苜蓿葉蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH 清除能力的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，不同DH的苜蓿葉蛋白解物對(duì)DPPH清除能力均隨底物濃度的增加而提高，當(dāng)濃度為2.o mg/mL時(shí)，抑制率在50%—90%之間，顯示出較強(qiáng)的DPPH清除能力。這是因?yàn)闃悠窛舛仍礁?，其中所含有的抗氧化性的氨基酸短肽就越多，從而抗氧化性就越?qiáng)。DPPH清除力也隨著DH的增大而逐漸增大，當(dāng)DH為21. 60%時(shí)達(dá)到最高（85.78%），然后隨著DH的升高而逐漸下降。這說(shuō)明酶解產(chǎn)物的抗氧化性與其DH有關(guān)，水解度大小對(duì)肽段長(zhǎng)短和游離氨基酸的相對(duì)含量是至關(guān)重要的，如水解度太小，則肽段過(guò)長(zhǎng)，具有抗氧化性的一些氨基酸未能斷裂，抗氧化性較低；如水解度太大，雖游離氨基酸含量過(guò)高，但疏水性氨基酸含量下降而導(dǎo)致抗氧化性降低。所以，控制適當(dāng)?shù)乃舛瓤梢垣@得較高抗氧化性活性的苜蓿葉蛋白肽。

3 結(jié)論

本研究進(jìn)行了pH值和溫度兩個(gè)復(fù)合蛋白酶水解苜蓿葉蛋白制備寡肽的單因素實(shí)驗(yàn)，最終選取水解度有一定差異的6個(gè)苜蓿葉蛋白酶解物作為研究對(duì)象。通過(guò)抗氧化活性實(shí)驗(yàn)得出，不同DH的苜蓿葉蛋白解物對(duì)DPPH 清除能力均隨底物濃度的增加而提高，當(dāng)濃度為2.o mg/mL時(shí)，抑制率在50%—90%之間，顯示出較強(qiáng)的DPPH 清除能力。DPPH 的清除力也隨著DH的增大呈現(xiàn)先升高后逐漸下降的趨勢(shì)。所以說(shuō)明水解度和抗氧化活性有一定關(guān)系，但并非正相關(guān)，控制適當(dāng)?shù)乃舛瓤梢垣@得抗氧化性活性較高的苜蓿葉蛋白肽。

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