高產(chǎn)葡萄糖酸黑曲霉菌株的誘變選育

白長(zhǎng)勝 孟維珊

摘要：以一株產(chǎn)葡萄糖酸的黑曲霉為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外線誘變處理，篩選得到一株產(chǎn)葡萄糖酸較高的菌株，產(chǎn)酸力比原始菌株提高了1. 16倍，經(jīng)連續(xù)傳代7代，產(chǎn)酸性能未出現(xiàn)較大的差異，具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；葡萄糖酸；紫外線誘變；產(chǎn)酸能力

中圖分類號(hào)：TQ921.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-9737（2018）08-0001-02

葡萄糖酸及其衍生物（如葡萄糖酸鹽、葡萄糖酸δ- 內(nèi)酯）作為蓬松劑、凝固劑、鰲合劑、酸味劑而廣泛應(yīng)用于食品、化工、水處理、建材和醫(yī)藥等行業(yè)[1-2]。葡萄糖酸的生產(chǎn)方法包括發(fā)酵法、均相化學(xué)氧化法、電解氧化法和多相催化氧化法[3]。生物發(fā)酵法是當(dāng)前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)葡萄糖酸最有競(jìng)爭(zhēng)力的生產(chǎn)方法，具有發(fā)酵周期短、發(fā)酵過(guò)程易于控制、發(fā)酵液純度高、產(chǎn)品易于提取、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)。能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸的微生物很多，工業(yè)上主要使用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸[4-5]。

紫外線誘變是一種使用最早、沿用最久且應(yīng)用效果明顯的誘變方法，該方法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、成本低廉、誘變頻率高、誘變效果明顯，迄今仍然是微生物育種中最常用和有效的誘變方法之一。本研究以篩選到的產(chǎn)葡萄糖酸性能較高的黑曲霉為出發(fā)菌株，利用紫外線誘變處理原始菌株，篩選得到產(chǎn)酸能力高、遺傳性能穩(wěn)定的突變菌株。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉YS由黑龍江省畜牧研究說(shuō)微生物實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖60 g/L，尿素0.2 g/L，KH2P04 0.13 g/L，MgS04.7H20 0.02 g/L，玉米漿l g/L，CaC035 g/L，瓊脂25 g/L，pH值6.5～7.O，121℃，滅菌15 min。

1.2.2 平板培養(yǎng)基

葡萄糖250 g/L，尿素0.2 g/L，KH2P04 0.13 g/L，MgS04·7H20 0.02 g/L，玉米漿1 g/L，CaC03 10 g/L，瓊脂18 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，滅菌20 min。

1.2.3 種子培養(yǎng)基

葡萄糖240 g/L，尿素0.2 g/L，KH2 P040.64 g/L，玉米漿7.2 g/L，CaC03 10 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，滅菌20 min。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖300 g/L，尿素0.1g/L，KH2 P040.02 g/L，MgS04·7H20 0.2g/L，CaC03 40 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，滅菌20 min。1.3 試劑與儀器

試劑：葡萄糖，尿素，MgS04.7H20，KH2 P04，瓊脂，CaC03，甲醇，磷酸。

儀器：搖床，培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，高壓滅菌鍋，磁力攪拌器，血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，高效液相色譜儀，pH計(jì)。

1.4 方法

1.4.1 單孢子懸液制備

黑曲霉YS作為出發(fā)菌株，用無(wú)菌水5 mL沖洗下培養(yǎng)好的新鮮斜面孢子，用玻璃珠打散，脫脂棉過(guò)濾，制得單孢子懸浮液，取0.5 mL用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)菌懸液濃度[6]，調(diào)整孢子液濃度為每毫升l07～l08個(gè)孢子。

1.4.2 紫外誘變

取5 mL孢子懸液于直徑5 cm培養(yǎng)皿中，加入自制轉(zhuǎn)子，置于磁力攪拌器上，在15 W紫外燈下、距離30 cm分別照射不同時(shí)間，然后將處理液梯度稀釋后取104稀釋度菌懸液0.1 mL處理液涂布于分離培養(yǎng)基平板，35℃避光培養(yǎng)3～5天后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。以未誘變菌液培養(yǎng)后的菌落數(shù)為基準(zhǔn)計(jì)算不同誘變時(shí)間的致死率，繪制致死率曲線，確定誘變劑量并進(jìn)行誘變。

致死率（%）=（對(duì)照皿的菌落總數(shù)誘變處理后的菌落總數(shù)）/對(duì)照皿的菌落總數(shù)×100%

1.4.3 突變株的篩選

初篩：將菌落周圍溶圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株挑至斜面上，純化后進(jìn)行復(fù)篩發(fā)酵。

復(fù)篩：挑取活化后的菌種接種于裝有40 mL種子培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，38℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，然后取5 mL轉(zhuǎn)接于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，38℃、300 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，濾紙過(guò)濾后測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖酸的含量，以原始菌株YS產(chǎn)葡萄糖酸量作為對(duì)照，選取產(chǎn)酸量較高的菌株。

1.5 葡萄糖酸含量的測(cè)定

過(guò)濾后的發(fā)酵液稀釋100倍后，用HPLC測(cè)定葡萄糖酸含量。

HPLC檢測(cè)條件：色譜柱為Amethyst C18 H（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇：水：1%磷酸一50：450：500，流速1.O mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.6 菌株遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將誘變菌株連續(xù)傳代7代后，7代菌株同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定產(chǎn)酸量。

2 結(jié)果

2.1 紫外誘變劑量的選擇

采用紫外線誘變方法將菌懸液用紫外線分別照射o、0.55、l、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5 min后，通過(guò)平板菌落記數(shù)法計(jì)算致死率，繪制紫外照射致死率曲線，結(jié)果如圖l所示。

紫外照肘o.5 min的致死率為43. 3%，1 rmn的致死率為75. 8%，1.5 min的致死率為88. 7%，2 min的致死率為95. 2%，2.5 min的致死率為99.7%，照射3 min及以上的致死率為100%。根據(jù)誘變育種的產(chǎn)量變異中大多傾向于采用較低劑量的原則[7]，本試驗(yàn)選取致死率為80%的誘變劑量，將紫外誘變紫外線照射的時(shí)間取為1.5 min。

2.2 紫外誘變篩選

紫外照射后的菌株涂布平板，初篩后共挑取117株，經(jīng)搖瓶復(fù)篩測(cè)產(chǎn)算量，以YS產(chǎn)葡萄糖酸量為100%，產(chǎn)酸量提高的菌株有61株，但多數(shù)提高幅度不大，其中6株突變株的產(chǎn)酸能力提高到Y(jié)S誘變前的1.1倍以上，結(jié)果見(jiàn)表l。

2.3 菌株的遺傳穩(wěn)定性

以誘變后產(chǎn)酸量提高明顯的6株菌株為實(shí)驗(yàn)菌種，在斜面上連續(xù)傳代7代，將所有代次菌株接種搖瓶發(fā)酵，測(cè)定產(chǎn)酸量，繪制突變株產(chǎn)酸穩(wěn)定性曲線，結(jié)果如圖2。

Fig2 The stability of acid production by mutant strains

由圖2可知，而菌株UF13、UF35、UF62和UF74的產(chǎn)酸不夠穩(wěn)定，隨著代數(shù)增加它們的產(chǎn)酸能力均有所下降。菌株UF20和UF107產(chǎn)酸性能基本穩(wěn)定，表明二者遺傳穩(wěn)定性良好。UF107的產(chǎn)酸性能優(yōu)于UF20，因此選用菌株UF107作為以后發(fā)酵產(chǎn)酸的出發(fā)菌株。

3 討論

葡萄糖酸與碳酸鈣反應(yīng)在平板上形成透明圈，本研究采用透明圈法作為初步判定菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng)弱的依據(jù)。一般認(rèn)為透明圈直徑比與產(chǎn)酸量呈現(xiàn)正相關(guān)性。透明圈越大，產(chǎn)酸越多；透明圈出現(xiàn)得越早，產(chǎn)酸越快，在實(shí)驗(yàn)中篩選得到的多數(shù)突變菌株產(chǎn)酸能力符合這種正相關(guān)性。采用這種初篩方法大大提高了篩選效率。

本試驗(yàn)通過(guò)紫外線誘變處理黑曲霉原始菌株YS，最終篩選得到一株產(chǎn)葡萄糖酸能力提高且性狀穩(wěn)定的菌株UF107，產(chǎn)酸力是原始菌株1.16倍。

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