菠蘿對(duì)乙烯利誘花的敏感性差異研究

張紅娜 劉勝輝 孫偉生 李運(yùn)合 孫光明 林文秋 張秀梅 吳青松

摘 要 為了解造成2種不同類(lèi)型菠蘿品種對(duì)乙烯敏感性差異的發(fā)生環(huán)節(jié)，進(jìn)一步揭示乙烯促進(jìn)菠蘿成花的分子機(jī)制，本研究以乙烯敏感型‘巴厘菠蘿品種和乙烯鈍感型‘臺(tái)農(nóng)16菠蘿品種為試材，對(duì)乙烯催花過(guò)程中成花基因及乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中乙烯受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和核內(nèi)調(diào)控等過(guò)程涉及基因的表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：AcERS1a、AcETR2a、AcETR2b、AcCTR1、AcENI2和AcERFs等基因在2種成花類(lèi)型中的差異可能是導(dǎo)致2個(gè)品種對(duì)乙烯信號(hào)感知敏感度不同的重要原因；AcERS1a、AcERS1b、AcETR2a和AcETR2b等乙烯受體可能參與乙烯誘導(dǎo)菠蘿成花信號(hào)的感知，然后通過(guò)AcCTR1下調(diào)和AcENI2上調(diào)將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)調(diào)控基因（AcEIN3和AcERFs），從而啟動(dòng)菠蘿成花關(guān)鍵基因AcFT和花器官形態(tài)建成重要基因AcAP1的表達(dá)，引起菠蘿成花的生物學(xué)效應(yīng)，這將為進(jìn)一步闡明乙烯誘導(dǎo)菠蘿成花的分子機(jī)制提供參考，也為利用基因工程手段開(kāi)展菠蘿新品種選育研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 菠蘿；乙烯；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；受體；基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào) S668.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Ethylene Induced Sensitivity of Difference Pineapple Varieties

ZHANG Hongna， LIU Shenghui， SU Weisheng， LI Yunhe， SUN Guangming， LIN Wenqiu，

ZHANG Xiumei， WU Qingsong*

Key Laboratory for Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture/ South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract In order to explore the sensitivity difference to ethylene between ethylene sensitive cultivar ‘Bali and ethylene insensitive cultivar ‘Tainong 16， and further clarify the molecular mechanisms of flowering induced by ethylene in pineapple， the expression profiles of flowering genes and ethylene-related genes during floral induction were studied by the real-time quantitative PCR method. Results showed that the expression difference of AcERS1a， AcETR2a， AcETR2b， AcCTR1， AcENI2 and AcERFs during flower-bud formation might be the main reasons causing the difference in ethylene sensitivity of the two cultivars. The ethylene receptors AcERS1a， AcERS1b， AcETR2a and AcETR2b might participate in signal perception of flowering induced by ethylene， then by down-regulation of AcCTR1 and up-regulation of AcENI2， the signal was transmited to AcEIN3 and AcERFs， to initiate the expression of flowering genes AcFT and AcAP1， and raise the biological effects of floweing. The study would provide a reference to clarify the molecular mechanism of pineapple flowering induced by ethylene， and provide scientific bases for genetic engineering breeding.

Key words pineapple； ethylene； signal transduction； ethylene receptors； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.008

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merr]，鳳梨科鳳梨屬多年生單子葉草本，是世界三大熱帶水果之一[1]。菠蘿苗生長(zhǎng)到一定程度或葉片達(dá)到一定數(shù)量可自然成花，但菠蘿自然開(kāi)花易受個(gè)體營(yíng)養(yǎng)差異及溫度、水分和栽培環(huán)境等外界因素影響，導(dǎo)致開(kāi)花時(shí)間不一致和開(kāi)花率低等問(wèn)題[2-3]。因此，生產(chǎn)上多采用人工誘導(dǎo)開(kāi)花的方式，即當(dāng)菠蘿達(dá)到一定營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)量之后，噴施乙烯利等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)其成花，這種方式既能保證菠蘿在市場(chǎng)上的周年供應(yīng)，又能調(diào)節(jié)開(kāi)花時(shí)間一致易于管理。目前，利用乙烯利對(duì)菠蘿進(jìn)行人工誘花（生產(chǎn)上俗稱(chēng)“催花”）已成為菠蘿生產(chǎn)中普遍使用的栽培技術(shù)[4-6]。在我國(guó)，菠蘿栽培品種相對(duì)單一，‘巴厘和‘卡因是目前的主栽品種，其中‘巴厘約占全國(guó)的80%以上[7]。近年來(lái)，隨著本地品種種性退化及市場(chǎng)對(duì)菠蘿品質(zhì)需求的多樣化，國(guó)內(nèi)對(duì)菠蘿新品種引進(jìn)及推廣工作也日益升溫，但新品種（如臺(tái)農(nóng)系列）試種及推廣中發(fā)現(xiàn)菠蘿不同品種間對(duì)乙烯利誘花的敏感度存在較大差異[8-9]。對(duì)于一些果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良但難以催花（對(duì)乙烯不敏感）的品種，生產(chǎn)中一般選擇淘汰或任其自然開(kāi)花來(lái)獲得一定的產(chǎn)量，這嚴(yán)重影響了果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良品種的引種和良種推廣工作。目前，造成不同品種對(duì)乙烯敏感度差異的原因尚不清楚，因此系統(tǒng)深入研究乙烯誘導(dǎo)菠蘿開(kāi)花的內(nèi)在機(jī)理尤為必要。

近年來(lái)，借助分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的方法，植物乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已逐步被闡明，在擬南芥中確立了一條從定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的乙烯受體到核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的線(xiàn)性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（linear signal transduction pathway）[10]。乙烯受體是該途徑中最上游的感應(yīng)元件，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)有5個(gè)乙烯受體，分別為ETR1（ethylene response 1）、ETR2（ethylene response 2）、ERS1（ethylene response sensor 1）、ERS 2（ethylene response sensor 2）和EIN2（ethylene insensitive 2），受體下游是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)控因子CTR1（constitutive triple response 1）[11～14]；EIN2位于CTR1的下游，是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的正調(diào)控因子；EIN3（ethylene insensitive 3）/EIL1（EIN3 like 1）是位于EIN2的初級(jí)轉(zhuǎn)錄因子[12，15-16] 。乙烯受體蛋白結(jié)合乙烯后抑制了CTR1的磷酸化能力，激活膜蛋白EIN2，使得轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL1在核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)[11-14]；EIN3蛋白則通過(guò)結(jié)合到Ethylene Response Factors（ERFs）基因的啟動(dòng)子區(qū)，調(diào)控后者的表達(dá)，最終啟動(dòng)植物體對(duì)乙烯信號(hào)的應(yīng)答響應(yīng)[17]。此外，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還涉及到了磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄反饋調(diào)節(jié)以及蛋白和mRNA的降解調(diào)控等一系列的調(diào)控機(jī)制[15，18]。

在生產(chǎn)實(shí)踐和新品種試種過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同菠蘿品種對(duì)乙烯利催花的敏感度存在較大差異，有些品種如‘Moris、‘Josapine和‘臺(tái)農(nóng)18對(duì)乙烯敏感，易催花；而卡因類(lèi)的‘Sawarak和‘Mosapine對(duì)乙烯不敏感，催花難[19]。張治禮等[1]研究發(fā)現(xiàn)‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)4品種對(duì)乙烯敏感的范圍較大，而低濃度的乙烯則無(wú)法誘導(dǎo)‘臺(tái)農(nóng)11、‘臺(tái)農(nóng)16和‘臺(tái)農(nóng)17開(kāi)花。因此，本研究以乙烯敏感型的‘巴厘菠蘿品種和乙烯鈍感型的‘臺(tái)農(nóng)16菠蘿品種為試材，通過(guò)比較乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中乙烯受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)特征的變化，初步揭示造成2種類(lèi)型菠蘿品種對(duì)乙烯敏感差異的發(fā)生環(huán)節(jié)，為進(jìn)一步闡明乙烯促進(jìn)菠蘿成花的機(jī)制及利用基因工程手段開(kāi)展菠蘿新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)16兩個(gè)菠蘿品種作為試材，于2017年6月份在廣東省湛江市南亞熱帶作物研究所科研示范基地進(jìn)行。每個(gè)品種選取300株健康菠蘿植株，均分為3個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)100株菠蘿植株，當(dāng)生長(zhǎng)期達(dá)到16個(gè)月，單株成熟葉片達(dá)到35片時(shí)，使用800 mg/L乙烯利（40%水劑）灌心，催花。分別在催花后0、1、2、4 d及1、2、4 w時(shí)，隨機(jī)剝?nèi)∶總€(gè)小區(qū)10株處理的植株頂芽，于液氮速凍后放于-80 ℃保存，用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。每個(gè)小區(qū)采樣后各剩余的30株植株正常管理，用于成花效應(yīng)統(tǒng)計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈合成 總RNA提取使用北京華越洋生物科技有限公司針對(duì)多糖多酚植物的Quick RNA isolation Kit，具體方法參照說(shuō)明書(shū)。總RNA提取后，分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA的濃度和純度。然后每個(gè)樣品取2.0 mg總RNA，用Thermo Fisher公司的High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit合成cDNA第一鏈，具體操作均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 乙烯合成途徑相關(guān)基因的RT-qPCR分析 參照Real-time PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則，使用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)乙烯合成途徑相關(guān)基因的Real-time PCR引物，委托天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司（廣州）合成（表1）。Real-Time PCR反應(yīng)使用Roche公司的Light Cycler? 480I system完成，試劑采用Applied Biosystems公司的Power SYBR Green PCR Master Mix。反應(yīng)總體積為20 mL：10 mL 2×SYBR qPCR Mix，上、下游引物各1 mL（0.5 mmol/L），1 mL cDNA模板（約50 ng）和7 mL滅菌雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s。隨后進(jìn)行65～95 ℃熔解曲線(xiàn)分析，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。使用Actin作為內(nèi)參基因[20]，每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分析 運(yùn)用2—△△CT法[21]計(jì)算AcFT等成花基因及AcERS1a等乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)16號(hào)乙烯利處理后的成花表現(xiàn)及成花基因表達(dá)規(guī)律

乙烯利處理后‘巴厘菠蘿的成花率高達(dá)98.8%，而‘臺(tái)農(nóng)16菠蘿的成花率則僅為76.7%，顯著低于‘巴厘品種（表2）。

從圖1-A可以看出，‘巴厘菠蘿頂芽中AcFT的表達(dá)量在乙烯利催花4 d后開(kāi)始迅速增加并保持

持續(xù)上升，至處理后4 w時(shí)達(dá)到最高值；而‘臺(tái)農(nóng)16菠蘿頂芽中AcFT的表達(dá)量也是在乙烯利催花4 d后開(kāi)始增加，處理2 w達(dá)到最高水平，隨后逐漸下降?！屠宀ぬ}頂芽中AcFT的表達(dá)量從4 d時(shí)起極顯著的高于‘臺(tái)農(nóng)16?！屠屙斞恐蠥cAP1的表達(dá)規(guī)律與AcFT基因類(lèi)似（圖1-B），也是在乙烯利處理4 d后逐漸增加，約4 w時(shí)達(dá)到最高值；而‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中AcAP1的表達(dá)量在乙烯利催花4 d后開(kāi)始增加，2 w后達(dá)到最高值，隨后有所下降，但其整體表達(dá)水平明顯低于‘巴厘品種（圖1-B）。

2.2 ‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)16號(hào)乙烯利催花后乙烯受體基因的表達(dá)變化

通過(guò)對(duì)AcERS1a等乙烯受體的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中AcERS1a的表達(dá)量在乙烯利催花1 d后達(dá)到最高值，然后持續(xù)下降急劇下降2 d時(shí)達(dá)到最低水平，隨后又有所回升并保持在一個(gè)穩(wěn)定水平。而‘巴厘頂芽中AcERS1a的表達(dá)則無(wú)明顯變化，且整體水平顯著地低于‘臺(tái)農(nóng)16（圖2-A）；乙烯催花后，‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中AcERS1b表達(dá)量均迅速增加，并在處理后1 d時(shí)達(dá)到最高水平，隨后逐漸下降，處理4 w后降至最低水平，兩者的變化規(guī)律極為相似（圖2-B）；

‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中AcETR2a的表達(dá)量在乙烯利催花1 d后達(dá)到最高值，且極顯著的高于‘巴厘品種，隨后急劇下降2 d時(shí)達(dá)到最低水平，然后又稍微上升保持相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平。而‘巴厘頂芽中AcETR2a的表達(dá)則相對(duì)較為平穩(wěn)，變化幅度不大（圖2-C）；‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中AcETR2b的表達(dá)量在乙烯處理1 d后迅速增加，極顯著的高于‘巴厘品種，隨后急劇下降然后維持在一個(gè)較低水平，而‘巴厘頂芽中AcETR2b的表達(dá)與‘臺(tái)農(nóng)16類(lèi)似，但變化幅度較?。▓D2-D）。

2.3 ‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)16號(hào)乙烯利處理后乙烯信號(hào)傳導(dǎo)基因的表達(dá)特征

從圖3可知，乙烯利催花后AcCTR1的表達(dá)量在‘臺(tái)農(nóng)16中呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，而‘巴厘頂芽中AcCTR1的表達(dá)則是在處理后1 d時(shí)達(dá)到最高值，隨后又下降，且整體表達(dá)水平顯著地低于‘臺(tái)農(nóng)16（圖3-A）；‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中AcEIN2的表達(dá)變化規(guī)律較為相似，乙烯處理1 d后迅速增加，隨后下降然后維持在一個(gè)較低水平，但整體表達(dá)水平‘巴厘顯著地高于‘臺(tái)農(nóng)16（圖3-B）。

2.4 ‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)16號(hào)乙烯利催花后乙烯核內(nèi)調(diào)控基因的表達(dá)差異

從圖4-A的結(jié)果可以看出，‘巴厘和‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中AcEIN3的表達(dá)均在乙烯處理1 d后迅速增加，‘巴厘的AcEIN3表達(dá)量隨后下降至4 d時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)后又逐漸上升。AcERF1和AcERF3在乙烯利處理后的表達(dá)規(guī)律相似，均是在‘巴厘品種乙烯利處理后1 d時(shí)達(dá)到表達(dá)高峰，而在‘臺(tái)農(nóng)16品種中呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)（圖4-B～C）；且兩個(gè)基因在‘巴厘品種中的表達(dá)量顯著地高于同時(shí)期的‘臺(tái)農(nóng)16。AcERF11則表現(xiàn)出與其它兩個(gè)ERF基因完全相反的規(guī)律，‘臺(tái)農(nóng)16中AcERF11的表達(dá)量在乙烯利催花處理后急劇下降，在2 d時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，隨后又逐漸上升，而‘巴厘品種則無(wú)明顯的變化（圖4-D）。

3 討論

3.1 乙烯利處理后2個(gè)菠蘿品種的成花差異

植物FLOWERING LOCUS T （FT）同源基因在決定植物成花調(diào)控上起著關(guān)鍵作用[22-24]，APETALA1（AP1）在植物花器官形態(tài)建成中起著重要作用[25-26]，菠蘿花芽誘導(dǎo)期是其生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，是一個(gè)復(fù)雜的形態(tài)建成過(guò)程，與其果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量密切相關(guān)[27]。在菠蘿自然成花具有極大不確定性的前提下，其人工調(diào)控菠蘿成花已成為國(guó)內(nèi)外菠蘿研究者和種植者重點(diǎn)關(guān)注的研究領(lǐng)域之一。目前，許多專(zhuān)家學(xué)者已針對(duì)不同品種，不同種植條件和不同施用方法，對(duì)外源刺激誘導(dǎo)菠蘿成花進(jìn)行了系列研究，確認(rèn)了乙烯是目前唯一被證實(shí)能夠直接啟動(dòng)菠蘿生殖生長(zhǎng)的激素[5]，并發(fā)現(xiàn)乙烯利誘導(dǎo)菠蘿開(kāi)花是通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)源乙烯的生物合成發(fā)揮作用，菠蘿的成花還會(huì)受到植株重量、品種類(lèi)型、環(huán)境條件等其它因素的影響[27-28]。近年，菠蘿新品種引進(jìn)及推廣工作也備受關(guān)注，但新品種（如臺(tái)農(nóng)系列）試種及推廣中發(fā)現(xiàn)菠蘿不同品種間對(duì)乙烯利誘花的敏感度存在較大差異。一些品種如‘臺(tái)農(nóng)13、‘臺(tái)農(nóng)16和‘臺(tái)農(nóng)17等對(duì)乙烯的敏感性較差，不易催花，屬乙烯鈍感型品種；而‘巴厘和‘Perola 等品種易受乙烯誘導(dǎo)開(kāi)花，屬乙烯敏感型品種[1]。本研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論：乙烯敏感型菠蘿品種‘巴厘催花后成花率達(dá)到了98.8%，而乙烯鈍感型菠蘿品種‘臺(tái)農(nóng)16乙烯催花率只有76.7%，相同濃度的乙烯利誘導(dǎo)后，‘巴厘品種的成花率顯著地高于‘臺(tái)農(nóng)16。從成花關(guān)鍵基因FT及花器官形態(tài)建成重要基因AP1的表達(dá)量來(lái)看，‘巴厘頂芽中AcFT和AcAP1的表達(dá)量均明顯高于‘臺(tái)農(nóng)16，說(shuō)明了乙烯敏感型菠蘿品種對(duì)相同濃度的乙烯利處理后成花響應(yīng)更加強(qiáng)烈，成花表現(xiàn)更為明顯。

3.2 乙烯利處理后乙烯受體相關(guān)基因的表達(dá)差異

乙烯與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答有密切關(guān)系，參與植物種子萌發(fā)、花器官形成、果實(shí)發(fā)育和成熟、根伸長(zhǎng)、葉和花的衰老等植物發(fā)育過(guò)程的調(diào)控[16]。在擬南芥等模式植物建立的整個(gè)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為：C2H2→ETR1/ERS1/EIN4/ETR2/ERS2 →CTR1→EIN2→EIN3/ERFs→乙烯生物學(xué)效應(yīng)[29]，但在鳳梨科植物中乙烯誘導(dǎo)其開(kāi)花的機(jī)理目前尚不清楚。乙烯受體是乙烯的信號(hào)感知元件，Li等[20]在乙烯敏感型‘Perola菠蘿中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)感知乙烯信號(hào)的受體AcERS1a、AcERS1b、AcETR2a和AcETR2b，其熒光定量PCR結(jié)果表明，與AcERS1a和AcERS1b相比，AcETR2a 和AcETR2b對(duì)乙烯利處理更敏感；乙烯利處理后早期尤其是處理后1～2 d時(shí)，AcERS1b、AcETR2a 和AcETR2b有一個(gè)表達(dá)高峰，相比較而言AcERS1a的相對(duì)表達(dá)量變化較小。從本研究的結(jié)果可以看出，2個(gè)品種中AcERS1b和AcETR2b的表達(dá)規(guī)律類(lèi)似，均在乙烯利催花后1 d左右迅速增加，隨后逐漸降低，與Li等[20]的結(jié)果一致。而AcERS1a和AcETR2a的表達(dá)量則在乙烯鈍感型菠蘿品種‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中的表達(dá)量明顯高于乙烯敏感型‘巴厘品種。‘臺(tái)農(nóng)16中AcERS1a和AcETR2a也是乙烯處理后1 d左右出現(xiàn)表達(dá)高峰，且極顯著的高于‘巴厘品種。與Li等[20]的結(jié)果不一致的是，AcERS1a和AcETR2a在同為乙烯敏感型的‘巴厘品種中表達(dá)無(wú)明顯變化，這可能因?yàn)樗玫钠贩N或者植株?duì)顟B(tài)及處理季節(jié)等不同所導(dǎo)致的。最近研究表明，不同乙烯受體成員在不同生物學(xué)過(guò)程中起不同的作用[30-33]，在西紅柿中，只有某些特定的乙烯受體調(diào)節(jié)果實(shí)的成熟，但是其它受體在這一生物學(xué)過(guò)程基本上沒(méi)有什么作用[31]；在擬南芥中，ETR1與ETR2基因在鹽脅迫下的種子萌發(fā)過(guò)程中起著相反的功能[33]。本研究結(jié)果表明：AcERS1b和AcETR2b可能在乙烯誘導(dǎo)兩種菠蘿成花中起著重要的作用，而AcERS1a、AcETR2a和AcETR2b則很可能是兩個(gè)品種菠蘿產(chǎn)生成花差異的主要原因。

3.3 乙烯利處理后乙烯信號(hào)傳導(dǎo)及核內(nèi)調(diào)控基因的表達(dá)差異

乙烯受體蛋白結(jié)合乙烯后抑制了Raf-like Ser/Thr蛋白酶對(duì)CTR1的磷酸化能力，使得膜蛋白EIN2被激活[11-12]。作為乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要基因，CTR1和 ENI2分別協(xié)同負(fù)調(diào)控和正調(diào)控乙烯反應(yīng)[15]。從本實(shí)驗(yàn)2個(gè)品種AcCTR1和AcENI2的表達(dá)特征來(lái)看，乙烯催花后‘巴厘頂芽中AcCTR1的表達(dá)量逐漸下降，‘臺(tái)農(nóng)16頂芽中AcCTR1的表達(dá)量催花后1 d左右略微增加，隨后也逐漸下降。乙烯敏感型菠蘿品種‘巴厘頂芽中AcCTR1表達(dá)量極顯著地低于乙烯鈍感型菠蘿品種‘臺(tái)農(nóng)16，這表明CTR1在負(fù)調(diào)控菠蘿響應(yīng)乙烯反應(yīng)中可能起著重要作用。而‘巴厘AcENI2的表達(dá)量明顯高于‘臺(tái)農(nóng)16，這說(shuō)明相比于乙烯鈍感型菠蘿品種‘臺(tái)農(nóng)16，乙烯利更容易激活乙烯敏感型菠蘿品種‘巴厘的膜蛋白AcENI2。綜上，AcCTR1和AcENI2在2個(gè)類(lèi)型品種中的表達(dá)差異可能是其對(duì)乙烯敏感度差異的主要因素之一。

核內(nèi)調(diào)控基因EIN3/EIL和ERF依次位于CTR1下游，正調(diào)控乙烯反應(yīng)[15]。在‘蜻蜓鳳梨的研究已證明EIN3受乙烯信號(hào)誘導(dǎo)，可能在乙烯誘導(dǎo)鳳梨開(kāi)花中起重要作用[34-35]。乙烯處理后，在成花的‘蜻蜓鳳梨中，AfEIN3的表達(dá)量在1 h即達(dá)到峰值，然后逐漸下降。我們本研究的結(jié)果中兩個(gè)菠蘿品種均在乙烯利處理后1 d時(shí)AcEIN3表達(dá)達(dá)到峰值，這與‘蜻蜓鳳梨出現(xiàn)高峰的時(shí)間存在一定差異，可能是由于物種不同所致。處理前期，乙烯敏感型菠蘿品種‘巴厘頂芽中AcEIN3表達(dá)量要顯著地高于乙烯鈍感型菠蘿品種‘臺(tái)農(nóng)16，2個(gè)品種間AcEIN3的表達(dá)差異也可能是導(dǎo)致其對(duì)乙烯敏感性差異的重要原因之一。EIN3蛋白通過(guò)結(jié)合到ERFs的啟動(dòng)子上來(lái)調(diào)控后者的表達(dá)，最終啟動(dòng)乙烯的應(yīng)答響應(yīng)[15]。ERFs基因編碼的是一類(lèi)家族蛋白，這類(lèi)蛋白屬于A(yíng)PETALA2 /Ethylene Response Element Binding Protein（簡(jiǎn)稱(chēng)AP2 /EREBP）家族。ERFs基因家族在擬南芥等植物中已被大量研究[36-39]，但在菠蘿中尚未見(jiàn)詳細(xì)的報(bào)道，僅在鳳梨科植物‘蜻蜓鳳梨中有少量報(bào)道。雷明等[40-43]在‘蜻蜓鳳梨中已經(jīng)克隆出3個(gè)ERF家族基因，并證明其響應(yīng)了外源乙烯調(diào)控，且表達(dá)量在外源乙烯處理后呈現(xiàn)正調(diào)控趨勢(shì)。本研究結(jié)果表明：在乙烯敏感型菠蘿品種‘巴厘中，AcERF1和AcERF3受外源乙烯的正調(diào)控，在乙烯利處理后1 d時(shí)有個(gè)表達(dá)高峰，這與‘蜻蜓鳳梨的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似；但這2個(gè)基因則在‘臺(tái)農(nóng)16品種中呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，這可能是導(dǎo)致兩個(gè)品種對(duì)乙烯信號(hào)差異響應(yīng)的另一個(gè)重要原因。AcERF11則表現(xiàn)出與其它2個(gè)ERF基因完全相反的規(guī)律，說(shuō)明ERF家族基因不同成員在乙烯誘導(dǎo)菠蘿成花中可能起著不同的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)乙烯敏感型的‘巴厘菠蘿品種和乙烯鈍感型的‘臺(tái)農(nóng)16菠蘿品種催花后菠蘿品種間的成花效應(yīng)、ERS1a和 CTR1乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因及FT和AP1等重要成花基因的表達(dá)特征差異分析發(fā)現(xiàn)：ERS1b、AcETR2a、AcETR2b、AcCTR1、AcENI2、AcEIN3、AcERF1和AcERF3等基因在2種成花類(lèi)型中的差異可能是導(dǎo)致不同品種對(duì)乙烯信號(hào)感知敏感度不同和成花效應(yīng)差異的重要原因；ERS1b、ETR2a和ETR2b等乙烯受體可能參與乙烯誘導(dǎo)菠蘿成花信號(hào)的感知，然后通過(guò)CTR1和 ENI2將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)調(diào)控基因（EIN3、ERF和ERF3），從而啟動(dòng)菠蘿成花關(guān)鍵基因FT和花器官形態(tài)建成重要基因AP1的表達(dá)，從而引起菠蘿成花的生物學(xué)效應(yīng)。這些結(jié)論將為乙烯誘導(dǎo)菠蘿成花分子機(jī)制的闡明提供重要參考和研究思路。

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