一株耐鋁甜瓜枯萎病拮抗細(xì)菌的分離鑒定及其耐鋁特性研究

李怡 彭文濤 李勤奮 鄧曉 吳東明 譚華東 武春媛

摘 要 從甜瓜根際酸性土壤中分離篩選到1株耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，命名為A2。根據(jù)表型、生理生化特征和16S rRNA基因序列相似性分析，將其鑒定為Pseudomonas sp.。菌株A2對甜瓜枯萎病病原菌的相對防效為68.3%，且拮抗能力具有遺傳穩(wěn)定性。相比AlCl3處理，菌株A2對Al2（SO4）3表現(xiàn)出了更好的耐受性，最高可耐受Al3+ 50 mmol/L。在含有A13+的S-LB培養(yǎng)基中，菌株最適生長溫度為30 ℃；培養(yǎng)基初始pH值的降低會(huì)加劇A13+對菌株A2的毒害作用。研究結(jié)果為含活性鋁的酸性土壤中甜瓜枯萎病的生物防治提供優(yōu)良菌株資源和理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 耐鋁；細(xì)菌；甜瓜枯萎病拮抗菌；耐鋁能力；耐鋁特性

中圖分類號 S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Isolation， Identification of An Aluminum-tolerant Bacteria Strain Antagonizing Fusarium Wilt of Muskmelon and Its Al-tolerant Characteristics

LI Yi1，2， PENG Wentao1， LI Qinfen1，2， Deng Xiao1，2， Wu Dongming1，2， Tan Huadong1，2， Wu Chunyuan1，2*

1 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Experiment Station of Agricultural Environment Scientific Observation in Danzhou， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract An aluminum-tolerant bacteria strain antagonizing fusarium wilt of muskmelon， A2， was isolated from the rhizospheric soils of muskmelon. Based on the phenotypic， physiological， biochemical characteristics and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences， it was identified as Pseudomonas sp.. A2 showed strong antagonistic effect against Fusarium oxysporum and its relative control effect was 68.3%. A2 showed higher tolerant ability for Al2（SO4）3 than AlCl3， and it was tolerant to 50 mmol/L Al3+. The optimal temperature for the growth of A2 in medium containing Al3+ was 30 ℃， and the decreasing initial pH of the medium aggravated the toxic effect of A13+ on strain A2. This study would provide a new resource and theoretical basis for the biocontrol of fusarium wilt of muskmelon in acid and aluminum soils.

Key words aluminum-tolerance； bacteria； bacterium antagonizing fusarium wilt of muskmelon； Al-tolerant ability； Al-tolerant characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.021

我國酸性土壤遍布南方15個(gè)省市，總面積達(dá)2.03×108 hm2，約占全國耕地面積的21%[1]。酸性土壤中，活性鋁易以離子態(tài)釋放到土壤中，對植物、微生物具有非常大的毒害作用[2-3]。在酸性土壤中，鋁毒導(dǎo)致鉀、鈣等營養(yǎng)元素缺乏；鋁易在根中大量積累，干擾植物養(yǎng)分的吸收及運(yùn)輸，是限制植物生長的主要因子之一[4]。鋁作用于微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核和多種細(xì)胞器，影響微生物的物質(zhì)和能量代謝，抑制微生物的生長和發(fā)育。土壤中的富鋁化作用隨著酸性沉降及酸性肥料的大量施入而加劇，環(huán)境中活性鋁的數(shù)量呈明顯增加的趨勢[5]。

微生物具有生長快、易變異等特點(diǎn)。經(jīng)鋁毒脅迫后而存活的土壤微生物，其解鋁毒能力是決定鋁毒危害程度的重要因素[6]。細(xì)菌在微生物中所占比例最大，與真菌相比，具有易培養(yǎng)、生長速度快、遺傳背景相對簡單等特點(diǎn)。耐鋁微生物，尤其是耐鋁細(xì)菌，可為耐鋁機(jī)制研究提供合適的模式生物體，為耗時(shí)較長的植物耐鋁新品種培育提供理論基礎(chǔ)。

甜瓜是我國的重要水果作物，但在酸性土壤中受鋁毒害嚴(yán)重，易發(fā)生甜瓜枯萎病。甜瓜枯萎病是由甜瓜專化型尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f. sp.Melonis）引起的土傳病害，被稱為瓜類作物的“癌癥”。土壤中一旦存在甜瓜枯萎病菌將很難被根除，在連作地上表現(xiàn)尤為明顯[7]。目前，生物防治為甜瓜枯萎病的主要防治手段。生物防治是利用生物的代謝產(chǎn)物或生物體本身來拮抗病原菌，來源一般為自然界本身，對環(huán)境和人類安全無害，但須通過人為定量添加生防菌株至土壤中使其增殖，生防菌株在施用后普遍因不適應(yīng)土壤環(huán)境而定殖能力不強(qiáng)，導(dǎo)致應(yīng)用時(shí)防治效果較差。因此，鋁毒土壤中甜瓜枯萎病拮抗菌的定殖能力，成為關(guān)系甜瓜產(chǎn)量的重要因素。

甜瓜枯萎病拮抗菌的分離篩選已有研究報(bào)道，菌株種類包括木霉菌屬[8]、放線菌[9]、芽孢桿菌屬[10-11]等。生防菌株要具備耐鋁特性，才可成功應(yīng)用于有鋁毒的酸性土壤，但國內(nèi)外目前均無報(bào)道表明生防菌株具有耐鋁特性。本研究針對甜瓜大部分生長環(huán)境為鋁毒土壤，鋁脅迫較嚴(yán)重，易感染甜瓜枯萎病，且拮抗菌在鋁毒土壤中定殖能力較低、生物防治效果不理想的實(shí)際情況，試圖從土壤中分離出耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，研究其耐鋁特性，為提高生防菌株在原位條件下的耐鋁效果及定殖能力提供新的資源和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品，取自海南澄邁甜瓜根際磚紅壤，采集地表5～15 cm土壤，pH值為5.13。

甜瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f. sp.Melonis）FJAT-9230，來源于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所農(nóng)業(yè)微生物研究中心。

50 %多菌靈可濕性粉劑，購自江蘇揚(yáng)農(nóng)化工有限公司。

Pseudomonas azotoformans DSM 18862，購自德國微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 耐鋁甜瓜枯萎病細(xì)菌的分離篩選及拮抗指數(shù)、遺傳穩(wěn)定性、相對防效的測定 參照小西茂毅等的方法配制S-LB培養(yǎng)基[12]。在90 mL含20 mmol/L Al3+、pH 5.0的S-LB液體加10 g土壤樣品，于30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，梯度稀釋后涂布于固體S-LB 培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)5 d，待平板出現(xiàn)單菌落后，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落在S-LB培養(yǎng)基平板上劃線純化，直至單菌落形態(tài)一致且細(xì)胞染色在顯微鏡下觀察形態(tài)一致。

將篩選到的耐鋁細(xì)菌，參照鄒立飛[13]的方法，稍加改進(jìn)，進(jìn)行平板對峙、繼代培養(yǎng)、相對防效測定試驗(yàn)。

平板對峙試驗(yàn)：以甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9230為指示菌，將病原菌活化后，用孔徑5 mm 的打孔器制成菌餅，取1塊菌餅到PDA 平板中央，將待測菌株點(diǎn)接于距平板中心25 mm處的4個(gè)點(diǎn)上， 30 ℃培養(yǎng)5 d后，測定該P(yáng)DA培養(yǎng)基中上述菌株的抑菌圈半徑、拮抗菌半徑，計(jì)算拮抗指數(shù)。

抑菌圈半徑=拮抗菌菌餅中心至病原菌菌絲邊緣的距離

拮抗指數(shù)=（抑菌圈半徑﹣拮抗菌半徑）/拮抗菌半徑。

繼代培養(yǎng)試驗(yàn)：將菌株連續(xù)傳代，逐代進(jìn)行平板對峙試驗(yàn)，計(jì)算拮抗指數(shù)，確定菌株抑菌活性的穩(wěn)定性。

相對防效測定：盆栽土壤為磚紅壤，pH值為4.98。將病原菌FJAT-9230制成孢子懸浮液（濃度為1×106 cfu/mL），拮抗菌制成1×108 cfu/mL菌懸液，甜瓜（金輝1號）緩苗后，接種拮抗菌株和病原菌液，二者接菌量為10 mL，以只接種病原菌、清水和50%多菌靈可濕性粉劑500倍液作為陰性和陽性對照，每個(gè)處理10盆，每盆1株甜瓜苗，3次重復(fù)。7 d后觀察發(fā)病情況，15 d后計(jì)算發(fā)病指數(shù)和相對防效。

甜瓜苗期枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn)[14]：0級，莖基部無褐變；1級，莖基部褐變；2級，莖基部1/2處褐變；3級，莖基部2/3處以上褐變；4級，莖基部到頂端所有維管束褐變，根部壞死。

病情指數(shù)=[Σ（病級株數(shù)×病害級數(shù)）/（該處理盆栽苗總和×發(fā)病最重級的代表數(shù)值）]×100。

相對防治效果=[（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)] ×100%。

1.2.2 菌株形態(tài)觀察、生理生化特征的確定及分類地位分析 菌株菌落形態(tài)、生理生化特征的確定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]和《Bergey's Manual of Determinative Bacteriology》[16]。

菌體總DNA的提取方法為改良CTAB法 [17-18]。

菌株16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增以其基因組DNA為模板，采用通用引物。正向引物為5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′，反向引物為5′-TACCTTGT TACGACTT-3′[19]。

擴(kuò)增體系（50 μL）如下：10×Buffer 5.0 μL，Mg2+（25 mmol/L） 4.0 μL，dNTP（10 mmol/L）

5.0 μL，正向引物（25 μmol/L） 1.0 μL，反向引物（25 μmol/L） 1.0 μL，菌株基因組DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 0.5 μL，滅菌雙蒸水

至50 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，

56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物通過1%，GoldView染色的瓊脂糖電泳后，凝膠成像儀檢測。用DNA凝膠回收試劑盒回收基因片段，TA克隆后進(jìn)行測序（由華大基因完成）。根據(jù)16S rRNA 基因的測序結(jié)果，在http：// eztaxon-e.ezbiocloud.net/下載同源性較高的16S rRNA基因序列[20]，用MEGA version 5.0 軟件采用鄰接法[21]構(gòu)建降解菌株的 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[22]。

1.2.3 不同形態(tài)Al3+處理對菌株生長的影響 參照王超等[23]的方法，稍加改動(dòng)。將不同形態(tài)的Al3+[AlCl3、Al2（SO4）3]滅菌后加入S-LB培養(yǎng)基中，Al3+終濃度為30 mmol/L。將菌株用不加Al3+的S-LB培養(yǎng)至OD600=0.5，以2%接種量接種于含不同形態(tài)Al3+的S-LB中，于30 ℃、160 r/min培養(yǎng)72 h，定時(shí)取樣，測定OD600，以菌株在不含Al3+的S-LB培養(yǎng)基上的生長情況作為對照，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，繪制菌株在含有不同形態(tài)Al3+的S-LB培養(yǎng)基中的生長曲線。

1.2.4 菌株耐鋁能力分析 菌株耐鋁能力的測定采用點(diǎn)接法。制備菌液，離心，無菌蒸餾水洗滌2 次后重新懸于1 mL 無菌蒸餾水中，調(diào)至OD600值為0.5。將重懸后的菌液再稀釋10、100倍后，各取3 μL點(diǎn)涂于含不同濃度（0、10、30、50、60 mmol/L）Al3+[[Al2（SO4）3]的固體S-LB培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，以分類地位較為接近的Pseudomonas azotoformans DSM 18862作為對照，3 d 后觀察培養(yǎng)結(jié)果。

1.2.5 pH對菌株在Al3+中生長的影響 設(shè)置S-LB培養(yǎng)基（含30 mmol/L Al3+）的pH值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，以無菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度至OD600=0.5，2%接種量，分別接種于上述培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)3 d，以菌株在不加Al3+的各pH值培養(yǎng)基的生長情況作為對照，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，測定菌株OD600。

1.2.6 溫度對菌株在Al3+中生長的影響 在S-LB培養(yǎng)基中加入Al3+，其終濃度為30 mmol/L，pH 5.0，無菌水洗菌，調(diào)至OD600=0.5，2%接種量，分別于不同的培養(yǎng)溫度下（20、25、30、35、40 ℃）培養(yǎng)3 d，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，測定菌株OD600。

1.2.7 陽離子對菌株生長的影響 參照王超等[23]的方法，稍加改動(dòng)。在pH 5.0的S-LB培養(yǎng)基中分別加入Na2SO4、K2SO4、MgSO4、Al2（SO4）3 ，使各陽離子的終濃度分別為90、90、45、30 mmol/L。將OD600值為0.5的菌液以2%接種量加入，以菌株在不含任何陽離子的S-LB培養(yǎng)基上的生長情況作為對照，30 ℃培養(yǎng)3 d，每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，測定菌株OD600。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鋁甜瓜枯萎病細(xì)菌的分離篩選及拮抗指數(shù)、遺傳穩(wěn)定性、相對防效的測定

從甜瓜根際土壤中分離到一株耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，命名為A2。菌株與病原菌平板對峙效果見圖1。結(jié)果表明，病原菌向拮抗菌株生長到一定程度即停止生長，有明顯的抑菌帶出現(xiàn)，病原菌菌絲發(fā)黑。

A：對照病原菌；B：平板對峙效果。

A： Fusarium oxysporum FJAT-9230； B： the result of pair culture.

菌株A2初代拮抗指數(shù)為2.03±0.14，轉(zhuǎn)接至20代時(shí)，仍對甜瓜枯萎病病原菌有明顯的拮抗效果，拮抗指數(shù)為1.87±0.22，與初代培養(yǎng)相比無明顯差別。說明菌株對病原菌的拮抗效果持久有效，有較好的遺傳穩(wěn)定性。

對病原菌的防效結(jié)果見表1。由表1可知，施用A2菌液處理后，病情指數(shù)明顯低于清水對照，表明菌株A2對甜瓜枯萎病病原菌具有良好防效（68.3%），與多菌靈處理的防治效果（72.1%）相當(dāng)。

2.2 菌株形態(tài)觀察、生理生化特征的確定及分類地位分析

對菌株A2的菌落及菌體形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，在S-LB平板上，菌株A2的菌落呈圓形，乳白色，光滑（圖2-A）；在透射顯微鏡下觀察，該菌為桿狀，有極生鞭毛，無芽孢（圖2-B）。

A： 菌株A2菌落形態(tài)照片； B： 菌株A2透射電鏡照片。

生理生化特征測定結(jié)果表明，該菌為革蘭氏陰性菌，可利用D-葡萄糖、D-甘露糖醇、L-阿拉伯糖、肌醇為碳源生長，硝酸鹽還原試驗(yàn)、過氧化氫酶、細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)為陽性，吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)為陰性。

菌株A2的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。結(jié)果表明菌株A2與假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）有較高的同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與Pseudomonas paralactis WS4992 的16S rRNA基因相似性最高，為99.44%，與Pseudomonas antarctica CMS 35 的16S rRNA基因相似性最低，為98.35 %；并且和Pseudomonas lactis、Pseudomonas azotoformans聚類在一個(gè)亞分支上。結(jié)合其生理生化特征及16S rRNA基因序列分析結(jié)果，將菌株A2鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

2.3 不同形態(tài)Al3+對菌株生長的影響

由于各種Al3+形態(tài)在水中的溶解度不同，本研究選取溶解度較好的AlCl3、Al2（SO4）3中2種形態(tài)的Al3+作為代表，研究其對菌株A2生長的影響，結(jié)果如圖4。結(jié)果表明，2種形態(tài)的Al3+濃度為30 mmol/L時(shí)，與不加Al3+的對照相比，菌株A2的生長受到一定抑制；但相比AlCl3處理，在Al2（SO4）3處理中，菌株A2進(jìn)入對數(shù)期的時(shí)間較早，且生長速率較快，菌株A2對Al2（SO4）3表現(xiàn)出了更好的耐受性。因此選取Al2（SO4）3中的Al3+作為后續(xù)的處理形態(tài)。

2.4 菌株耐鋁能力分析

通過觀察不同濃度的A2菌液在不同Al3+濃度S-LB培養(yǎng)基中的生長情況，對菌株A2的耐鋁能力進(jìn)行初步分析，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，Al3+濃度為10 mmol/L時(shí)，不耐鋁的對照菌株已停止生長，但菌株A2的生長并未受到抑制，與不加Al3+的處理相比，沒有明顯的區(qū)別。隨著Al3+濃度增大，菌株的生長逐漸受到抑制。當(dāng)Al3+濃度為50 mmol/L時(shí)，菌液稀釋100倍點(diǎn)接的菌株A2已停止生長，菌液未稀釋的和稀釋10倍點(diǎn)接的菌株A2仍然可以生長，但與不加Al3+和低濃度Al3+處理相比，生長受到明顯抑制，說明50 mmol/LAl3+已對菌株A2產(chǎn)生毒性。綜上所述，細(xì)菌A2可耐受50 mmol/L的Al3+，具有良好的耐鋁能力。

2.5 pH值對菌株在Al3+中生長的影響

當(dāng)pH值小于5時(shí)，活性鋁主要以A13+形式存在，而當(dāng)pH值超過6.0時(shí)，鋁離子易生成氫氧化鋁，出現(xiàn)絮狀沉淀，所以研究pH≤5.0時(shí)，菌株A2在Al3+中的生長情況。結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，A13+存在條件下，pH值的變化對菌株生長有顯著影響。pH值降低至4.0以下、Al3+濃度為30 mmol/L時(shí)，菌株的生長完全受到抑制。菌株在不加A13+的各個(gè)pH培養(yǎng)基中的OD600均大于有A13+的相應(yīng)處理的數(shù)值。在無A13+條件下，菌株可在pH 3.0的S-LB培養(yǎng)基中生長，可見，酸性條件會(huì)顯著加劇A13+對菌株A2的毒害作用。

同pH環(huán)境不同小寫字母表明不同處理在0.05水平上存在顯著差異。

Different lower-case letters in the same pH condition indicated significant differences at the 0.05 level.

2.6 溫度對菌株在Al3+中生長的影響

溫度對菌株A2在Al3+中生長的影響見圖6。結(jié)果表明，A13+存在條件下，菌株在25～35 ℃條件下生長情況較好，在20～25 ℃和35～40 ℃范圍內(nèi)OD600值較小，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，菌株生長幾乎停止。菌株A2最適生長溫度為30 ℃。

2.7 陽離子對菌株生長的影響

研究同等正電荷量的不同陽離子對菌株A2生長的影響，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，與不加任何陽離子處理的空白對照相比，同等電荷量的Na+、K+、Mg2+并未對菌株A2生長產(chǎn)生抑制，而高濃度A13+顯著抑制了菌株生長。這表明A13+對菌株A2產(chǎn)生細(xì)胞毒性，主要原因并不是離子強(qiáng)度過高致使細(xì)胞質(zhì)濃度降低、滲透勢升高，細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)失敗。

3 討論

在A13+易于對生物產(chǎn)生毒性、耐鋁細(xì)菌難以篩選[24]、細(xì)菌的耐鋁機(jī)制研究進(jìn)展緩慢的前提下，本研究篩選到了一株耐鋁細(xì)菌A2。以分子操作相對簡單但研究成果較少的細(xì)菌，進(jìn)行耐受性相關(guān)的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究，將成為今后揭示生物耐鋁機(jī)制的重要手段。菌株A2可作為研究耐鋁機(jī)制的良好對象。

甜瓜枯萎病主要利用生物手段防治，但拮抗菌因不具有耐鋁特性，定殖能力低，無法在鋁毒土壤中起作用；而甜瓜根際土壤中分離得到的耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，可能對甜瓜耐鋁具有重要作用。綜上所述，同時(shí)具有高效耐鋁及防治甜瓜枯萎病兩種功能的菌株A2，作為研究材料具有唯一性，可能在鋁毒土壤中具有較高的定殖能力，能夠更好的應(yīng)用于鋁毒嚴(yán)重的酸性土壤中的甜瓜枯萎病的生物防治。菌株A2進(jìn)行連續(xù)傳代后，仍能保持較高的拮抗指數(shù)，其拮抗能力的遺傳穩(wěn)定性有利于菌株在較長時(shí)間內(nèi)對甜瓜枯萎病病原菌FJAT-9230起到抑制作用。研究結(jié)果表明，菌株A2可延遲發(fā)病時(shí)間，延緩病害發(fā)展速度。

王超等[23]研究發(fā)現(xiàn)，紅酵母RS1對Al2（SO4）3 的忍耐能力高于AlCl3。本研究考察了Al3+形態(tài)對革蘭氏陰性細(xì)菌A2生長的影響，結(jié)果表明菌株A2亦對Al2（SO4）3表現(xiàn)出了更好的耐受性，Al3+形態(tài)對菌株生長有顯著影響。耐鋁能力測定結(jié)果表明，菌株A2對A13+并無依賴性，較低濃度的A13+并不能促進(jìn)菌株的生長。本研究中還發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始pH下降會(huì)加劇A13+對菌株A2的毒害作用，與Al3+存在著疊加效應(yīng)。引起上述現(xiàn)象的原因，可能與菌株耐鋁的分子機(jī)制有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

本研究分離篩選到1株耐鋁甜瓜枯萎病拮抗菌，命名為A2 ，經(jīng)鑒定其為Pseudomonas sp.，A2最高可耐受50 mmol/LAl3+。對菌株A2防效及其拮抗能力的遺傳穩(wěn)定性、耐鋁特性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果可為鋁毒嚴(yán)重的酸性土壤中的甜瓜枯萎病的生物防治提供優(yōu)質(zhì)菌株資源和理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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