HPLC法·酶法和間苯二酚法檢測(cè)生物制品中唾液酸含量方法學(xué)比較

秦湫紅 朱愛華

摘要 [目的]比較高效液相色譜法（HPLC）、酶法及間苯二酚法測(cè)定唾液酸濃度的準(zhǔn)確性、靈敏性和線性范圍，探討3種方法的實(shí)際應(yīng)用特點(diǎn)。[方法]建立HPLC、酶法和間苯二酚法測(cè)定唾液酸濃度的方法，并分別使用3種方法同時(shí)測(cè)定同種生物制品中的唾液酸濃度。[結(jié)果]HPLC法線性范圍為0.3～2 500.0 μg/mL，回收率為98.0%～99.2%，日內(nèi)、日間RSD分別為0.8%～1.4%和1.6%～1.8%。酶法線性范圍為0.6～20.0 μg/mL，回收率為102.0%～106.5%，日內(nèi)、日間RSD分別為3.5%～4.2%和4.0%～4.6%。間苯二酚法線性范圍為39～1 250 μg/mL，回收率為98.2%～100.2%，日內(nèi)、日間RSD分別為2.9%～3.3%和3.0%～3.5%。[結(jié)論]3種方法回收率和精密度差異無(wú)顯著性，但高效液相色譜法更加簡(jiǎn)單、便捷、成本低廉、靈敏度高且線性范圍較寬，廣泛適合生物制品中唾液酸含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 唾液酸；高效液相色譜法；酶法；間苯二酚法；方法學(xué)

中圖分類號(hào) S131 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）20-0162-02

Abstract [Objective]The research aimed to determine the accuracy，sensitivity and linearity of sialic acid concentration by high performance liquid chromatography （HPLC），enzymatic and resorcinol methods，and discuss the practical application characteristics of the three methods.[Method]Establishing methods for the determination of sialic acid concentration by HPLC，enzymatic and resorcinol methods，and determining the sialic acid concentration in the same biological products using the three methods.[Result]The linear range of HPLC method was 0.3-2 500.0 μg/mL，and the recovery rate was 98.0%-99.2%，withinday and daytoday RSD were 0.8%-1.4% and 1.6%-1.8% respectively.The linear range of enzymatic method was 0.6-20.0 μg/mL，and the recovery rate was 102.0%-106.5%，withinday and daytoday RSD were 3.5%-4.2% and 4.0%-4.6% respectively.The calibration curve of resorcinol method was 39-1250 μg/mL，and the recovery rate was 98.2%-100.2%，Withinday and daytoday RSD were 2.9%-3.3% and 3.0%-3.5% respectively.[Conclusion]There is no significant difference among the three methods in terms of recovery and precision，but HPLC is more simple，convenient，inexpensive，sensitive，and has a wide linear range，which can be widely used for the determination of sialic acid in biological products.

Key words Sialic acid；High performance liquid chromatography；Enzymic method； Resorcinol method；Methodology

唾液酸（Sialic acid，SA）又稱燕窩酸，是神經(jīng)氨酸經(jīng)N-乙酰化、O-乙酰化或N-羥乙?；蟮难苌?，其廣泛存在于哺乳動(dòng)物、脊椎動(dòng)物及多種植物中的細(xì)胞膜表面，以糖苷鍵鏈接到糖蛋白或糖脂的末端，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理功能[1]。唾液酸因具有提高人體免疫力[2]、提高記憶力和智力水平[3]以及抗癡呆[4]等作用而被廣泛關(guān)注。已有研究表明，唾液酸表達(dá)水平與疾病發(fā)生也密切相關(guān)，在糖尿病、腎病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及細(xì)菌感染的患者中唾液酸的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯異常[5]。目前唾液酸的含量測(cè)定有間苯二酚法[6]、酶法[7]以及高效液相色譜法[8]，但是這些方法都有自身的特點(diǎn)。該試驗(yàn)通過(guò)方法學(xué)研究這3種方法各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，為不同生物樣品唾液酸含量檢測(cè)選擇測(cè)定方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試液

唾液酸對(duì)照品[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；胎球蛋白[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]；唾液酸檢測(cè)試劑盒[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]；間苯二酚、磷酸、鄰苯二胺、鹽酸、硫酸銅、乙酸丁酯、丁醇、乙腈為分析純；高效液相色譜系統(tǒng)（戴安中國(guó)有限公司，型號(hào)UltiMate3000）；離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)TDZ6B-WS）；酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司，型號(hào)Spectramax Plus 384）。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

精密稱取唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品25.0 mg，加0.5%磷酸溶液至5 mL，配制成5 000 μg/mL唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，并稀釋成終濃度分別為2 500.0、1 250.0、625.0、313.0、156.0、78.0、39.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.3、0.6、0.3 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.2 HPLC法測(cè)定生物制品中唾液酸含量。

1.2.2.1 樣品制備。

精密稱取0.1 g奶粉溶于10 mL水中，混勻，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，除去上層油脂，或精密量取1 mL新鮮牛奶，加入磷酸至終濃度為0.5 %磷酸溶液并定容至10 mL，或精密稱取10 mg胎球蛋白用0.5 %磷酸溶液溶解并定容至10 mL，于沸水煮沸30 min，室溫冷卻后取0.5 mL與10 mg/mL鄰苯二胺溶液（0.5%磷酸溶液溶解）0.5 mL混勻，于60 ℃水浴40 min，置室溫冷卻。

1.2.2.2 含量測(cè)定。按照高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱溫30 ℃以0.1%磷酸∶乙腈（90∶10）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，對(duì)照品溶液及樣品溶液各進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算唾液酸含量。

1.2.3 酶法測(cè)定生物制品中唾液酸含量。

1.2.3.1 樣品制備。精密稱取0.05 g奶粉溶于10 mL水中，混勻，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，除去上層油脂，或精密量取0.5 mL新鮮牛奶，加入磷酸至終濃度為0.5% 磷酸溶液并定容至10 mL，或精密稱取5 mg胎球蛋白用0.5% 磷酸溶液溶解并定容至10 mL，于沸水煮沸30 min，置室溫冷卻。

1.2.3.2 含量測(cè)定。按照唾液酸檢測(cè)試劑盒操作方法，在樣品中加入930 μL Tris Reaction Buffer，吸取反應(yīng)溶液至比色皿中，將分光光度計(jì)在340 nm處調(diào)零，加入20 μL β-DADH Solution，反復(fù)吹打多次后在340 nm處讀取初始β-DADH吸光度。將反應(yīng)液重新吸回到原反應(yīng)管中，加入1 μL N-Acetylneuraminic Acid Aldolase和1 μL L-Lactic Dehydrogenase，反復(fù)吹打多次后于37 ℃水浴至少1 h，吸取反應(yīng)液至比色皿中，讀取最終340 nm處吸光度。計(jì)算唾液酸含量。

1.2.4 間苯二酚法測(cè)定生物制品中唾液酸含量。

1.2.4.1 樣品制備。精密稱取1 g奶粉溶于10 mL水中，混勻，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，除去上層油脂，或精密量取10 mL新鮮牛奶，加入磷酸至終濃度為0.5%，或精密稱取10 mg胎球蛋白用0.5%磷酸溶液溶解并定容至1 mL，于沸水煮沸30 min，置室溫冷卻。

1.2.4.2 含量測(cè)定。按照2015版《中國(guó)藥典》三部通測(cè)3102唾液酸測(cè)定法，將樣品100 μL置入10 mL玻璃試管中，每管加入間苯二酚-鹽酸溶液（分別量取2%間苯二酚溶液2.5 mL、0.1 mol/L硫酸銅溶液62.5 μL、 25%鹽酸溶液20 mL，加水稀釋至25 mL，混勻）1 mL，加蓋，沸水煮沸30 min，取出置冰浴中3 min后，沒管加乙酸丁酯-丁醇液（取乙酸丁酯4份與丁醇1份混勻）2 mL，充分混勻，室溫放置10 min，在波長(zhǎng)580 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法測(cè)定唾液酸含量線性關(guān)系 在“1.2.2.2”色譜條件下，唾液酸的保留時(shí)間為8.6 min峰形良好，分離完全。取標(biāo)準(zhǔn)溶液系列按“1.2.2.2”方法進(jìn)行測(cè)定。以所測(cè)得的唾液酸峰面積為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的唾液酸濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)做線性回歸，

得出回歸方程為Y=3.513 8X-1.247（R2=0.999 9），表明唾液酸在0.3～2 500.0 μg/mL線性良好。

2.2 酶法測(cè)定唾液酸含量線性關(guān)系 取標(biāo)準(zhǔn)溶液系列按照“1.2.3.2”操作。以所得的唾液酸光吸光度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的唾液酸濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)做線性回歸，得出回歸方程為Y=108.92X-4.192 7（R2=0.999 0），表明唾液酸在0.6～20.0 μg/mL線性良好。

2.3 間苯二酚法測(cè)定唾液酸含量線性關(guān)系

取標(biāo)準(zhǔn)溶液系列按照“1.2.4.2”操作。以所得的唾液酸光吸光度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的唾液酸濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)做線性回歸，

得出回歸方程為Y=3.743 5X-0.151 4（R2=0.999 6），表明唾液酸在39～1 250 μg/mL線性良好。

2.4精密度試驗(yàn)

取唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用HPLC法檢測(cè)10、20、39 μg/mL 溶液，用酶法檢測(cè)5、10、20 μg/mL 溶液，用間苯二酚法檢測(cè)20、39、78 μg/mL溶液，各每天檢測(cè)5次，計(jì)算日精密度，連續(xù)檢測(cè)5 d計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，3種方法均符合生物樣品分析要求。

2.5 回收率試驗(yàn)

取3種檢測(cè)方法各項(xiàng)下配制的奶粉1#樣品溶液（唾液酸含量分別為15.75、7.93、156.80 μg/mL），分別加入同體積的唾液酸對(duì)照品20、10、156 μg/mL，分別用3種方法檢測(cè)，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示（表1），3種方法均符合生物樣品分析要求。

2.6 生物制劑樣品中測(cè)定結(jié)果及比較 用3種方法檢測(cè)不同生物制品中唾液酸含量，結(jié)果見表2，3種方法所測(cè)得的唾液酸濃度結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)無(wú)顯著差異（P>0.05）。

以HPLC測(cè)定值為自變量X、酶法測(cè)定值為函數(shù)Y進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=0.990 4X+0.015 8（R2=0.999 0），可見HPLC法與酶法的相關(guān)性良好。以HPLC測(cè)定值為自變量X、間苯二酚法測(cè)定值為函數(shù)Y進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=0.980 7X+0.025 8（R2=0.998 0），HPLC法與間苯二酚法的相關(guān)性良好。

3 討論

目前檢測(cè)生物制品中唾液酸濃度的方法有高效液相色譜法、酶法和間苯二酚法等。酶法測(cè)定生物制品中唾液酸濃度具有準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但其成本較高，操作方法較為復(fù)雜，且線性范圍較窄。間苯二酚法是《中國(guó)藥典》收錄的傳統(tǒng)的測(cè)定唾液酸含量的方法，具有快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，但其靈敏度較差，線性范圍較窄。高效液相色譜法測(cè)定生物制品中唾液酸濃度具有快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、靈敏度高且線性范圍較寬的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛適用于生物制品中唾液酸含量的檢測(cè)。

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