福建省53份茶樹種質(zhì)資源SSR—PCR反應體系的優(yōu)化

朱晨　田采云　張舒婷

摘要[目的]優(yōu)化茶樹種質(zhì)資源SSR-PCR反應體系。[方法]以福建省不同地區(qū)的53份茶樹種質(zhì)資源作為SSR-PCR體系優(yōu)化的供試材料，通過L16（43）正交試驗設計，對茶樹SSR-PCR反應體系的3個影響因素：DNA模板濃度（ng/μL）、引物濃度（mmol/L）和Taq酶濃度（U）在4個水平上進行比較篩選，并進行PCR驗證。[結果]優(yōu)化后最佳的福建省茶樹SSR-PCR反應體系為25 μL體系，其中 DNA模板濃度50 ng/μL、引物濃度0.25 mmol/L、Taq酶濃度1.25 U。并從23對茶樹SSR引物中篩選出5對清晰、明亮、無雜帶的引物，適用于福建省茶樹SSR標記的進一步研究。[結論]該研究可為后續(xù)福建省茶樹品種的親緣關系分析、雜交品種的選育等研究提供依據(jù)。

關鍵詞茶樹；種植資源；SSR-PCR；體系優(yōu)化；正交設計

中圖分類號S571.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）28-0088-04

Optimization of SSRPCR Reaction System for 53 Tea （Camellia sinensis） Germplasm Resources in Fujian Province

ZHU Chen1，2， TIAN Caiyun1， ZHANG Shuting1，3 et al

（1.College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou，F(xiàn)ujian 350002；2.Key Laboratory of Tea Science in Fujian Province， Fuzhou，F(xiàn)ujian 350002；3.Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou，F(xiàn)ujian 350002）

Abstract[Objective]To optimize the SSRPCR reaction system for tea germplasm resources.[Method]Fiftythree tea plant germplasm resources in different regions of Fujian Province were used as the optimized materials for the SSRPCR system. Through the L16（43） orthogonal design， three factors affecting the SSRPCR reaction system of tea plant， DNA template concentration （ng/μL）， primer concentration （mmol/L） and Taq enzyme concentration （U） were screened at four levels， and PCR verification was performed. [Result]The optimum SSRPCR reaction system for tea in Fujian Province was 25 μL system， in which the concentration of DNA template was 50 ng/mL， primer concentration was 0.25 mmol/L， Taq enzyme concentration was 1.25 U. From 23 pairs of SSR primers， 5 pairs of primers with clear， bright and nostray bands were selected， which is suitable for further study on SSR markers of tea plants in Fujian Province. [Conclusion]This study provides a basis for the analysis of the genetic relationship and hybrid breeding of tea cultivars in Fujian Province.

Key wordsCamellia sinensis；Germplasm resource；SSRPCR；System optimization；Orthogonal design

茶樹（Camellia sinensis）屬于山茶科山茶屬，是多年生、木本、常綠植物，福建省是茶葉的主產(chǎn)地之一，該省茶樹栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富[1]。近年來隨著新品種選育研究和示范推廣工作的不斷深入，越來越多的優(yōu)良茶樹新品種對茶區(qū)產(chǎn)量和品質(zhì)提升起到了推動作用[2]。但優(yōu)質(zhì)茶樹種質(zhì)資源應用并不容易，因此，應進一步發(fā)掘、鑒定、篩選和推廣具有眾多優(yōu)良遺傳性狀的種質(zhì)資源[3]。傳統(tǒng)的育種方法選育周期長，親本選擇范圍有限，種質(zhì)資源的識別、鑒定困難等問題，限制了茶樹種質(zhì)資源研究工作的進一步深入。

SSR（simple sequence repeat）標記是以串聯(lián)重復DNA序列PCR擴增為核心的新型DNA分子技術[4]。SSR分子標記技術具有基因組覆蓋率、多態(tài)性高，多等位基因特性顯著，遺傳信息量大等優(yōu)點，在分子標記領域得到廣泛認可[5]，并已運用到眾多作物領域[6-8]。

已有報道顯示，由于不同茶樹品種的SSRs重復基元和重復次數(shù)都存在變異，同時SSRs兩側序列保守性高[9]，可以在SSRs的側翼序列上設計特異引物[10]，進行PCR擴增，電泳檢測，依據(jù)擴增產(chǎn)物的多態(tài)性位點對茶樹種質(zhì)資源進行識別、鑒定、研究和分析[11]。SSR技術作為一種理想可靠的分子標記技術可以運用于茶樹遺傳連鎖圖譜構建[12]、茶樹親緣關系[13]、茶樹遺傳多樣性[14]、茶樹種質(zhì)資源鑒定和新品種選育等研究中[15]。

福建省茶樹SSR技術研究起步較晚，適用于福建省茶樹SSR標記數(shù)據(jù)庫信息有限，國內(nèi)外有關福建省茶樹SSR-PCR體系優(yōu)化的報道較少，這在極大程度上制約了福建茶樹遺傳分析、種質(zhì)資源鑒定等研究的深入[16]。因此，建立適合福建省茶樹的SSR-PCR擴增體系至關重要。筆者以課題組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為依托，開發(fā)適用于福建省茶樹SSR的相關引物，并利用L16（43）正交試驗對福建省茶樹SSR-PCR反應體系進行優(yōu)化篩選，旨在建立穩(wěn)定高效的福建省茶樹SSR-PCR反應體系，為后續(xù)SSR分子標記技術應用于福建省茶樹親緣關系分析和遺傳多樣性分析，揭示當前福建省茶樹種質(zhì)資源的現(xiàn)狀提供技術支持。

1材料與方法

1.1材料

53份供試材料采自福建省7個地區(qū)（表1），采后將茶樹葉片置于密封袋中，經(jīng)液氮處理后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1茶葉DNA提取。

茶樹基因組DNA提取參照王磊等[17]的改良CTAB法，用2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度。

1.2.2SSR引物篩選。

根據(jù)茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)運用Primer 3程序，選取23對SSR引物進行篩選，SSR-PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，退火（溫度根據(jù)不同引物而定）1 min，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。選擇擴增條帶單一、清晰明亮、無嚴重拖帶的引物進行后續(xù)SSR-PCR反應體系的優(yōu)化研究。

1.2.3

SSR-PCR反應體系篩選。

采用L16（43）正交試驗設計，對茶樹SSR-PCR反應體系的3個影響因素：DNA模板濃度（ng/μL）、引物濃度（mmol/L）和Taq酶濃度（U）在4個水平上進行比較篩選，L16（43）正交試驗設計見表2。

1.2.4最適退火溫度篩選。

利用篩選出的SSR引物，根據(jù)各引物Tm值，選取48～56 ℃之間9個梯度的退火溫度進行試驗，根據(jù)退火溫度下的SSR-PCR擴增結果進行比較，確定各引物的最適退火溫度。

1.2.5SSR-PCR優(yōu)化體系驗證。

從篩選出的SSR引物中隨機選取一個引物，同時從53個茶樹DNA模板中隨機選取12個，根據(jù)2%瓊脂糖電泳檢測和10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）[18]的擴增結果綜合判斷福建省茶樹SSR-PCR優(yōu)化體系是否可靠。

2結果與分析

2.1SSR引物篩選結果

根據(jù)電泳結果顯示，23對引物中篩選出5對擴增結果符合預期的引物（G2、G6、G16、G19、G22），擴增條帶單一、清晰明亮、無嚴重拖帶、擴增效果最佳（圖1）。另外18對SSR引物存在擴增條帶多且不夠清晰明亮的問題。

2.2SSR-PCR體系優(yōu)化結果

根據(jù)茶樹SSR-PCR反應L16（43）正交試驗設計，PCR擴增后的電泳結果如圖2所示，16個組合中有10個組合的擴增條帶明亮，3號、4號、5號、6號、9號、11號和12號組合存在非特異性擴增條帶；1號、2號和7號主帶明顯，無非特異性擴增條帶，其中7號組合擴增出的條帶最為清晰明亮、單一、穩(wěn)定性最好且無其他雜帶，因此7號組合為最佳的SSR-PCR反應體系，該體系的組合為DNA模板50 ng/μL、引物0.25 mmol/L、Taq酶1.25 U。

2.3最適退火溫度的確定

退火溫度影響SSR引物與DNA模板的特異性結合，利用之前篩選出來的G2、G6、G16、G19和G22這5對最佳的SSR引物進行退火溫度PCR擴增，PCR電泳結果（表3）表明退火溫度過高或過低時，PCR擴增條帶都不太理想；當退火溫度為50～51 ℃時，各引物擴增的譜帶清晰豐富，因此確定后續(xù)SSP-PCR擴增體系驗證時的各引物的最佳退火溫度。

2.4SSR-PCR擴增體系驗證分析

在篩選出的G2、G6、G16、G19、G122這5對SSR引物中隨機選取G6引物，并從53份茶樹種質(zhì)資源中隨機選取12份DNA模板進行SSR-PCR擴增體系驗證，根據(jù)2%瓊脂糖凝膠電泳結果可知擴增條帶清晰明亮、單一、平整無雜帶（圖3）；同時10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）擴增電泳結果顯示SSR-PCR擴增體系擴增出的條帶清晰、多態(tài)性較強（圖4），以上結果表明該SSR-PCR優(yōu)化體系具有較好的穩(wěn)定性和可重復性，適用于福建省茶樹種質(zhì)資源的SSR分析研究。

3結論與討論

SSR分子標記檢測過程中最重要的環(huán)節(jié)就是PCR擴增，建立穩(wěn)定的SSR-PCR反應體系和擴增程序是SSR分析的必要前提。而SSR-PCR反應體系涉及諸多因素，各因素均可能對PCR擴增的敏感性、特異性和擴增產(chǎn)量產(chǎn)生影響[19]，如用未優(yōu)化的SSR-PCR體系進行試驗，會導致PCR擴增結果的準確性大大降低，不利于SSR分子標記發(fā)揮其應有的作用，從而進一步影響到后續(xù)的遺傳關系鑒定、親緣分析、雜交親本的選育、遺傳圖譜構建工作的開展[20]。一般進行SSR-PCR反應體系優(yōu)化的方法有2種，分別為正交試驗法和單因素試驗法。單因素試驗法過程繁瑣，需要根據(jù)各個因素的改變進行反復多次試驗，耗費成本高，且各因素間的互作效應易被忽略[21]。相比單因素試驗法，正交試驗設計就完全避免了以上缺陷。正交試驗設計既能做到分散性效果均衡檢測，又能綜合分析比較各個因素的互作影響，還可以對單個因素水平不同時的擴增結果進行檢測分析。該研究采用正交試驗設計法，通過DNA模板和引物的隨機抽取，盡量降低偶然性誤差對試驗結果的影響[22]，并進行非變性聚丙烯酰胺凝膠（Native-PAGE）SSR-PCR擴增體系優(yōu)化的驗證，從多方面確保SSR-PCR優(yōu)化體系結果的準確可靠[8]。

在SSR-PCR體系優(yōu)化試驗中，當DNA模板、引物和Taq酶濃度過高或過低時，會導致PCR擴增的重復性下降、堿基錯配、形成引物二聚體和非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生[23]。同時，退火溫度直接影響PCR的擴增效率和擴增產(chǎn)物的大小，過低的退火溫度易產(chǎn)生多條雜帶，不利于后續(xù)條帶統(tǒng)計分析，過高則PCR擴增準確度下降，目的條帶模糊。因此須對不同引物進行退火溫度篩選，以確定各引物的最適退火溫度[24]。

經(jīng)過SSR-PCR優(yōu)化體系和驗證試驗，確認福建省茶樹種質(zhì)資源最佳SSR-PCR反應體系為Taq酶1.25 U（12.5 μL）、ddH2O 9.5 μL、DNA模板1 μL（濃度50 ng/μL）、上下游引物各1 μL（濃度0.25 mmol/L），總體積25 μL。在這個反應體系下進行SSR-PCR反應體系優(yōu)化驗證，得到的條帶清晰明亮、平整、無雜帶和拖帶。表明該SSR-PCR優(yōu)化體系穩(wěn)定、可靠、重復性良好，可以進一步用于福建省茶樹種質(zhì)資源親緣關系分析、優(yōu)良品種選育等研究，為現(xiàn)有福建省珍稀茶樹種質(zhì)資源的鑒別和保護，建立省級優(yōu)良茶樹種質(zhì)資源的SSR指紋圖譜，以及福建省茶樹核心種質(zhì)資源庫的建立提供科學依據(jù)。

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