一個(gè)耐鎘基因過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定

嚴(yán)星星 歐陽劍 黃瑩

摘要 [目的]進(jìn)一步研究MNB1基因在植物應(yīng)對(duì)鎘脅迫響應(yīng)中的功能，構(gòu)建擬南芥中MNB1基因過量表達(dá)載體，通過篩選鑒定最終獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。[方法]以野生型擬南芥cDNA為模板，PCR擴(kuò)增MNB1基因全長，將該基因連接到過量表達(dá)載體上；然后將構(gòu)建成功的重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株GV3101，浸花法轉(zhuǎn)化野生型植株；最后利用轉(zhuǎn)基因篩選與遺傳鑒定獲得MNB1轉(zhuǎn)基因陽性植株。[結(jié)果]MNB1基因CDS全長1 368 bp，酶切連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌鑒定得到陽性菌落，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)完全正確。通過抗性篩選及PCR電泳檢測(cè)獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株。[結(jié)論]MNB1基因過表達(dá)載體構(gòu)建成功并獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)基因植株，為進(jìn)一步研究該基因調(diào)控植物鎘脅迫響應(yīng)中的功能及其分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 擬南芥；MNB1基因；過表達(dá)；轉(zhuǎn)基因植株

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）21-0116-03

Abstract [Objective]In order to further study the function of MNB1 gene in response to cadmium stress in plants， the overexpression vector of MNB1 gene in Arabidopsis was constructed， and the corresponding transgenic plants were finally obtained through screening and identification.[Method] The fulllength MNB1 coding sequence was amplified through PCR from cDNA of Arabidopsis （Col0） using specific primers and cloned into the overexpression vector. Then the resulting construct was transformed into Agrobacterium strain GV3101 for transformation into the Col0 plants by the floral dip method. The transgenic lines were isolated through antibiotic screening and genetic identification.[Result]The fulllength CDS of MNB1 gene was 1 368 bp， which was identified by enzyme digestion and transformed into E. coli. The positive clones were identified and the sequencing results were completely correct. Positive transgenic plants were obtained by resistance screening and PCR electrophoresis.[Conclusion]The construction of MNB1 gene overexpression vector was successful and the corresponding transgenic plants were obtained， which laid the foundation for further study on the function and molecular mechanism of this gene regulating plant stress response to cadmium.

Key words Arabidopsis thaliana；MNB1 gene；Overexpression；Transgenic lines

隨著人口快速增長、工業(yè)發(fā)展、工廠及生活廢棄物的排放以及農(nóng)業(yè)化肥、農(nóng)用藥物等施用量的不斷增加，許多有害有毒物質(zhì)不斷進(jìn)入土壤中，造成土壤重金屬污染，已經(jīng)成為世界性嚴(yán)峻的環(huán)境問題之一[1-2]。其中重金屬鎘是對(duì)動(dòng)植物具有高度毒性的最危險(xiǎn)的污染物之一，給生態(tài)環(huán)境和食品安全帶來了嚴(yán)重的威脅。鎘暴露可引起肺氣腫和骨質(zhì)疏松癥，導(dǎo)致人體肺、腎和骨骼的不可逆損傷[3]。在過量的重金屬暴露下，植物也會(huì)表現(xiàn)出生物量減少、葉片萎黃、抑制根系生長和形態(tài)改變，常常導(dǎo)致植物過度暴露死亡[4]。所以植物對(duì)重金屬例如鎘的耐受性和積累能力在植物修復(fù)和糧食安全中的潛在應(yīng)用激起了人們的興趣。植物對(duì)重金屬鎘脅迫的響應(yīng)機(jī)制主要包括降低金屬生物利用度、控制金屬流入、金屬螯合、促進(jìn)金屬外排和金屬誘導(dǎo)活性氧的解毒等途徑。植物通過大量的防御機(jī)制，包括復(fù)雜的天然免疫系統(tǒng)來保護(hù)自己免受各種各樣病原體，如細(xì)菌、真菌、病毒等的侵害[5]。植物可以區(qū)分自我與非我或檢測(cè)特定的病原體。通過信號(hào)介導(dǎo)的防御反應(yīng)能導(dǎo)致植物細(xì)胞壁的固化，生產(chǎn)微生物代謝產(chǎn)物和病理相關(guān)蛋白等[6]。信號(hào)分子，例如ROS、乙烯、SA和茉莉酸在激活防御機(jī)制的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要的角色[7]。

在前期研究的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)MNB1功能缺失突變體表現(xiàn)出對(duì)重金屬鎘敏感的表型，因此找到MNB1這個(gè)基因作為研究目標(biāo)。已有研究表明所有已知的植物凝集素可以分為12大凝集素家族[8]。植物體中的甘露糖結(jié)合凝集素，即MNB，在植物體受到病原體攻擊的防御信號(hào)傳導(dǎo)中起到關(guān)鍵性的作用。筆者擬通過構(gòu)建MNB1基因過量表達(dá)載體，篩選并鑒定得到的轉(zhuǎn)基因陽性植株，以期為進(jìn)一步研究該基因在植株應(yīng)對(duì)鎘脅迫響應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料。該試驗(yàn)所用的植物材料是擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞（Columbia，Col）生態(tài)型，記作WT（wild-type，Col-0），購自美國擬南芥種子資源中心。載體構(gòu)建所用質(zhì)粒pART27，大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101。

1.1.2

主要試劑。Easy Taq DNA Polymerase（TransGen）；T4-DNA Ligase（TaKaRa）；PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa）；限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I（NEB）；Agar，NaCl，Yeast extract，Tryptone，Gold View，DNA Loading buffer，Marker，dNTPs，異丙醇，氯仿，無水乙醇，75%乙醇，葡萄糖，蔗糖，Silwet L-77，MES，VB5等。

1.2 方法

1.2.1

Trizol法提取植物總RNA。從培養(yǎng)皿或處理液中用大槍頭將擬南芥幼苗樣品挑出，用濾紙將水分吸干，將樣品放入預(yù)冷的研缽，加入適量液氮，待液氮快干時(shí)立即迅速研磨至樣品粉碎。

粉碎后均勻加入1 mL Trizol（存于4 ℃冰箱），盡量使粉末被完全覆蓋。每次研磨完一個(gè)樣品應(yīng)立即置于冰上。研磨全部結(jié)束后室溫靜置5 min。在超凈工作臺(tái)中向每個(gè)樣品里快速加入200 μL氯仿，劇烈混勻15 s，可渦旋。室溫靜置3 min后，13 000 r/min、4 ℃離心15 min。離心結(jié)束后，取樣時(shí)保持離心角度不變，緩緩吸取上清液500 μL至新的EP管中，并做好標(biāo)記。此時(shí)應(yīng)輕緩地加入500 μL異丙醇，并立即輕輕顛倒混勻6～8次。

室溫靜置10 min后，13 000 r/min、4 ℃離心10 min。倒掉上清，留取沉淀（盡量倒干凈）。沿著管壁緩緩加入1 mL 75%乙醇（事先配好存于-20 ℃），勿吹打沉淀，8 000 r/min、4 ℃離心5 min。重復(fù)洗滌1次，倒掉上清，用黃槍頭將液體吸取干凈，盡量不要觸碰到沉淀。在超凈臺(tái)中晾干沉淀，使乙醇完全揮發(fā)，約8 min。加入30 μL DEPC水溶解沉淀，并置于60 ℃水浴鍋內(nèi)促進(jìn)溶解。吸取5 μL樣品檢測(cè)其純度和濃度。

1.2.2

大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。從-80 ℃冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞，迅速放在冰上解凍融化10 min。取5～10 μL連接產(chǎn)物加入50 μL感受態(tài)細(xì)胞中（在冰盒中操作，不可吹打，輕輕快速混勻），冰浴30 min。之后42 ℃熱激90 s，快速將管取出放在冰上靜置5 min。每管加入800 μL無菌液體LB培養(yǎng)基。在搖床上振蕩培養(yǎng)，設(shè)置280 r/min、37 ℃、45 min。4 000 r/min、離心5 min，棄上清。剩300～500 μL重懸涂布LB固體培養(yǎng)基的平板上，正置30 min吹干，再于37 ℃，倒置恒溫培養(yǎng)過夜。取出培養(yǎng)過夜的平板，在超凈工作臺(tái)中挑取單一菌落至LB液體培養(yǎng)基，每個(gè)EP管約300 μL，用槍頭挑菌。250 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基渾濁，5 h左右，進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.3 浸花法浸染擬南芥。將-80 ℃保存的菌種在含50 mg/L Spec、50 mg/L Gen的固體培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)，并劃線，挑取單菌落于500 μL的LB培養(yǎng)基（50 mg/L Spec，50 mg/L Gen）中，28 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。菌液搖勻后進(jìn)行PCR鑒定，取陽性菌液200 μL轉(zhuǎn)接到100 mL LB液體培養(yǎng)基（50 mg/L Spec，50 mg/L Gen）中，搖床培養(yǎng)至OD600 為1.2～1.6，于5 000 r/min離心10 min，棄上清，配制浸染緩沖液，重懸沉淀，再次離心，重復(fù)1次。加入適量緩沖液，將菌液稀釋至OD600為0.5～0.8，再按比例加入Silwet L-77。

用消毒剪去除已授粉的花、果莢，倒置于裝有滲透緩沖液的5 mL EP管中浸染20 s，使植株表面浸有一層水膜即可。將整盆野生型植株浸完后，貼上標(biāo)簽做好標(biāo)記，覆蓋保鮮膜以保持濕度，放在紙盒中避光培養(yǎng)，24 h后取下浸染后包上的薄膜，于室溫中繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增

為了驗(yàn)證MNB1基因在擬南芥應(yīng)對(duì)鎘脅迫調(diào)控中的功能，構(gòu)建了35S：：MNB1過量表達(dá)載體。首先進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，即克隆MNB1基因。以擬南芥幼苗為材料參照植物總RNA提取方法，提取植物的總RNA，提取時(shí)應(yīng)盡量避免mRNA降解，總RNA中包括mRNA、tRNA和rRNA，利用其中mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得植物的cDNA。再以cDNA為模板擴(kuò)增所需目的基因，結(jié)果見圖1。由圖1可知，獲得的基因片段與預(yù)期大小一致，所需目的片段大小為1 368 bp。

2.2 過表達(dá)載體的連接與轉(zhuǎn)化

為構(gòu)建MNB1的35S過表達(dá)載體，通過2種限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xho I分別酶切目的片段和pART27質(zhì)粒載體，該試驗(yàn)所用的pART27為改造過的質(zhì)粒，質(zhì)粒上加入Kpn I及Xho I酶切位點(diǎn)。酶切后進(jìn)行電泳檢測(cè)，酶切后基因和載體條帶清晰、大小正確，方可用于下一步試驗(yàn)。將酶切過的基因和載體用T4連接酶進(jìn)行連接，并用熱激法導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)過夜后如圖2所示。由圖2可知，初步通過抗性篩選獲得了重組質(zhì)粒單菌落，有待下一步鑒定。

2.3 陽性重組質(zhì)粒的PCR鑒定

為檢驗(yàn)克隆的MNB1基因序列信息是否正確和MNB1是否連接到重組質(zhì)粒上，用含相應(yīng)抗生素（該試驗(yàn)中使用壯觀霉素）的LB平板篩選陽性單克隆，菌落生長情況如圖2所示。再進(jìn)行菌落PCR，任意挑取7個(gè)單菌落，在裝有800 μL LB（含100 μg/mL壯觀霉素）的1.5 mL離心管中37 ℃培養(yǎng)4 h左右。取1～2 μL上清液作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖3。除了5號(hào)菌落，其他6個(gè)單菌落都是陽性重組質(zhì)粒。將圖3中1號(hào)菌液送到測(cè)序公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI blast比對(duì)后顯示，克隆到的MNB1基因序列完全正確，說明過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 轉(zhuǎn)基因株系的抗性篩選與鑒定

將測(cè)序正確的質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到GV3101農(nóng)桿菌菌株，用含有50 μg/mL壯觀霉素和50 μg/mL慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基，篩選鑒定陽性克隆，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，用轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌通過浸花法浸染野生型植株，收種。將收獲的種子干燥春化后撒到含有50 μg/mL卡那霉素的1/2 MS 平板上正常培養(yǎng)14 d，生長出正常的真葉與根，挑取生長嫩綠且有根的幼苗進(jìn)行移栽，抗性篩選結(jié)果如圖4所示。

移栽的植株培養(yǎng)到21 d左右時(shí)，剪取MNB1轉(zhuǎn)基因植株葉片，提取基因組DNA。PCR鑒定MNB1轉(zhuǎn)基因陽性株系，PCR鑒定電泳結(jié)果如圖5。由圖5可知，抗性篩選得到的植株都是轉(zhuǎn)基因陽性植株，都成功地過量表達(dá)了MNB1基因，這表明過表達(dá)載體構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因株系的篩選與鑒定都獲得了成功。

3 結(jié)論與討論

重金屬通過在食物鏈和飲用水中積累，對(duì)人體健康和環(huán)境造成潛在威脅[9-10]。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，植物修復(fù)技術(shù)治理土壤中重金屬污染，以及從源頭上控制農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全具有重大意義。該試驗(yàn)自擬南芥種質(zhì)資源中心獲得了擬南芥MNB1基因功能缺失型突變體，在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)該突變體對(duì)鎘脅迫表現(xiàn)敏感。于是通過基因工程技術(shù)構(gòu)建了MNB1過量表達(dá)載體，并通過浸花法轉(zhuǎn)入野生型植株中，篩選得到轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)一步進(jìn)行篩選與鑒定，最終獲得了MNB1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽性植株。這為對(duì)MNB1基因調(diào)控植物鎘耐受的機(jī)理做進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)，是一項(xiàng)十分有意義的研究性課題。

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