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    miR398和miR408 對UV-B脅迫下擬南芥幼苗的影響

    2021-11-02 00:18:58陜永杰張美萍冀麗蓉李丹張莉沈振國
    關鍵詞:活性氧過氧化擬南芥

    陜永杰,張美萍,冀麗蓉,李丹,張莉,沈振國

    1.山西師范大學地理科學學院,山西 臨汾,041000;2.山西師范大學生命科學學院,山西 臨汾,041000;3.南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,江蘇 南京,210094

    MicroRNAs (miRNAs)是一類參與 mRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼單鏈小 RNA,在植物器官形成、發(fā)育與分化信號通路及基因表達中均有重要作用[1].逆境脅迫可誘導某些 miRNA 表達并在多種脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[2,3].Sunkar等發(fā)現(xiàn),擬南芥幼苗的 CSD1 和 CSD2 在高濃度Cu2+和高濃度 Fe3+下的表達水平受miR398調(diào)控,消除氧化基團,減輕植物受脅迫的損傷[3~5].miR408 對低溫、干旱、重金屬等多種非生物脅迫均有響應[6,7].miR398 和miR408 雖可對植物遭遇的多種脅迫產(chǎn)生應答,但其應答機制有待研究.

    近年來,隨著氯氟烴化合物等大量使用,臭氧層加速損耗,臭氧層的減少導致到達地表面的UV-B(波長 280 nm~320 nm)輻射增加[8].研究表明,增強UV-B 輻射影響了植物的生長發(fā)育、生理生化過程、細胞活動、分子調(diào)控機制等均產(chǎn)生顯著變化[9~11].UV-B輻射引起的光氧化會對光合系統(tǒng)造成損傷,引起光抑制[12~14].UV-B 輻射對PSⅡ的影響要遠大于對PSⅠ的影響[15,16],損傷了捕光系統(tǒng)和耗散保護機制,破壞了植物的光合系統(tǒng),使其光合效率下降[17].UV-B脅迫下,膜脂過氧化及清除自由基的能力加劇.為應對脅迫,植物形成了一系列防御保護機制[18].Jia等在歐洲大葉楊中研究了24個miRNA發(fā)現(xiàn),在 UV-B 輻射下,13個miRNA上調(diào)表達,11個下調(diào)表達[19,20].本研究通過研究miR398 和miR408 對 UV-B 輻射脅迫的響應,為作物育種提供依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 材料及培養(yǎng) 選用哥倫比亞(Columbia-0)生態(tài)型野生擬南芥作為對照組,過表達miR398 和過表達miR408 擬南芥均購于擬南芥種子資源庫.用1 %的次氯酸鈉進行種子消毒,無菌水清洗,播種于MS培養(yǎng)基上,低溫(4 ℃)48 h,23 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),濕度為70 %,光照時間為 16 h,暗處理8 h,待擬南芥長出兩片真葉時移栽到土壤基質(zhì)(泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1)中,進行實驗處理.

    1.1.2 材料處理設置 共設置四個處理組,分別是正常光照下野生型擬南芥組(WT),過表達miR398/miR408 擬南芥組(miR398/miR408),UV-B 輻射下的野生型擬南芥組(WT-UVB),UV-B輻射下的過表達miR398/miR408 擬南芥組(miR398-UVB/miR408-UVB).光照強度為 2 000 Lx,培養(yǎng)溫度23 ℃,濕度為70 %,UV-B 輻射劑量為 10.08 kJ·m-2d-1,紫外燈光規(guī)格30 W,297 nm(南京華強生產(chǎn)),各實驗處理組設置如表1.

    表1 各實驗處理組的設置Tab.1 Setup of each experimental treatment group

    1.2 方法

    1.2.1 光合系統(tǒng)指標測定 移栽土壤培養(yǎng) 20 d 時進行指標測定,參考高俊鳳的方法[21],將各處理組的植物放在黑色罩中暗適應 30 min,選擇正常生長的葉片,在不離體的條件下用葉夾夾住葉片,測定初始熒光F0,最大熒光Fm,按公式Fv=Fm-F0為可變熒光Fv,F(xiàn)v/Fm為 PSⅡ最大光化學效率,再測得Fm′、F0′、Fs,根據(jù)計算公式測得:非光化學淬滅(NPQ)及光化學淬滅系數(shù)qP,公式如下

    Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

    1.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 采用氮藍四唑光還原法測定SOD酶活性.稱取 0.5 g 葉片,加入 2 mL 預冷的提取介質(zhì)于冰浴中研磨成漿液,定容至10 mL,取 5 mL提取液 4 ℃,10 000 r/min 離心 15 min,提取上清液即為 SOD 粗提取液,測定560 nm 處的吸光度.

    1.2.3 谷胱甘肽(GSH)含量的測定 采用 DINB 顯色法測定 GSH 含量,取 0.5 g 新鮮植物葉片,加入 5 mL 5 % TCA,充分研磨均勻,15 000 r/min 離心 15 min,取上清液 1 mL,加入 5 mL 磷酸緩沖液(pH=7.7,0.15 mmol/L),加入 30 μL DTNB,反應后,以 5 % TCA 為空白,于412 nm測定吸光度.

    1.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定 依照張志良的方法[22],稱取葉片 0.3 g,加入 2 mL 0.05 mol·L-1磷酸緩沖液,迅速研磨成漿液,加入5 mL 0.5 %硫代巴比妥酸提取液,沸水浴中沸騰 10 min,冷卻,離心,測定532 nm、600 nm、450 nm 處吸光度.

    1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用 SPSS 17.0 與 Origin 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行 LSD 和 DUNCAN 顯著性分析,并作圖.測定的試驗數(shù)據(jù)均選用P<0.05,從最高到最低標記 a、b、c、d.

    2 結(jié)果

    2.1 增強 UV-B 輻射對擬南芥各處理組葉綠素熒光動力學參數(shù)的影響

    Fv/Fm表示 PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率[23],由圖 1A 可知,正常生長情況下,野生型植株Fv/Fm高于過表達miR398 擬南芥,差異不顯著(P>0.05).UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥葉綠素熒光動力學參數(shù)Fv/Fm顯著下調(diào) 10.19%(P<0.05),過表達miR398 擬南芥顯著下調(diào) 16.18 % (P<0.05).表明UV-B 顯著降低了擬南芥的原初光能轉(zhuǎn)化效率,而miR398 的過表達更大程度上降低了植株原初光能轉(zhuǎn)化效率,損害植株生長.由圖 1B可知,正常光照下,野生型植株Fv/Fm高于過表達miR408 擬南芥,但差異不顯著(P>0.05).UV-B 輻射處理后,過表達miR408 擬南芥顯著下調(diào) 12.71%(P<0.05).表明 UV-B顯著降低了擬南芥的原初光能轉(zhuǎn)化效率,過表達miR408 進一步降低了植株的原初光能轉(zhuǎn)化效率,影響了光合能力,損害植株生長.

    圖1 擬南芥各處理組光合參數(shù) Fv/Fm 變化Fig.1 Changes of photosynthetic parameters Fv/Fm in Arabidopsis treatment groups

    qN非光化學淬滅表示的是植物耗散過剩光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力[24],由圖 2A 可知,正常光照下,野生型植株qN值低于過表達miR398 擬南芥,但差異不顯著(P>0.05).UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥qN值顯著上升 11.42%(P<0.05),過表達miR398 擬南芥顯著上升18.67%(P<0.05).表明在 UV-B 脅迫誘導下,miR398 基因調(diào)控擬南芥響應輻射,過表達miR398 擬南芥耗散過剩光能為熱能的能力更強,不利于植株生長.由圖 2B 可知,正常光照下,野生型植株qN值低于過表達miR408 擬南芥,差異不顯著(P>0.05).UV-B 輻射處理后,過表達miR408 擬南芥顯著上升 19.88%(P<0.05).表明在 UV-B 脅迫誘導下,過表達miR408 擬南芥耗散過剩光能為熱能的能力更強,影響植株生長.

    圖2 擬南芥各處理組光合參數(shù) qN 的變化Fig.2 Changes of photosynthetic parameters qN in Arabidopsis treatment groups

    qP光化學淬滅反映光系統(tǒng)Ⅱ (PSⅡ)原初電子受體QA的還原狀態(tài),qP越大,表明 PSⅡ電子傳遞活性越大[25].由圖 3A可知,正常光照下,野生型植株qP值高于過表達miR398 擬南芥(P>0.05).UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥qP值顯著下降 12.26%(P<0.05),過表達miR398 擬南芥顯著下降 17.90%(P<0.05).表明 UV-B 脅迫會降低擬南芥的 PSⅡ電子傳遞活性,而過表達miR398擬南芥進一步降低 PSⅡ電子傳遞活性,影響植株生長.由圖 3B 可知,正常光照下,野生型植株qP值高于過表達miR408 擬南芥,差異顯著(P<0.05).UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥qN值顯著下降 12.26%(P<0.05),而過表達miR408 擬南芥顯著下降 27.46%(P<0.05).表明在 UV-B 脅迫會降低擬南芥的 PSⅡ電子傳遞活性,而過表達miR408 基因的擬南芥進一步降低 PSⅡ電子傳遞活性,光合效率降低,影響植株生長.

    圖3 擬南芥各處理組光合參數(shù) qP 的變化Fig.3 Changes of photosynthetic parameters qP in Arabidopsis treatment groups

    以上結(jié)果表明,UV-B 脅迫葉綠素熒光動力學參數(shù)Fv/Fm、qP數(shù)值降低、qN數(shù)值升高,降低光合效率,而過表達miR398 和miR408 降低 UV-B 脅迫下的葉綠素熒光動力學參數(shù)Fv/Fm、qP數(shù)值、增加qN數(shù)值,降低光合作用效率,影響了植株生長發(fā)育.

    2.2 增強 UV-B 輻射對擬南芥各處理組中抗氧化酶活性的影響

    植物遭遇脅迫時,植物體調(diào)動抗氧化酶類(SOD酶、CAT酶、POD酶等的活性)和抗氧化物質(zhì)(GSH、AsA 等)含量清除活性氧及氧自由基等,從而降低脅迫造成的細胞損傷.植物的防御能力與抗氧化能力具相關性.由圖 4A 可知,正常光照下,野生型植株 SOD 酶活性高于過表達miR398 擬南芥(P<0.05).UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥 SOD 酶活性顯著下降22.42 % (P<0.05),過表達miR398 擬南芥顯著下降 48.97 % (P<0.05).表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 SOD 酶活性降低,而表達miR398 基因的擬南芥進一步降低 SOD 酶活性,從而 影響植物自我修復,對生長造成影響.由圖 4B 可知,正常光照下,野生型植株 SOD 酶活性高于過表達miR408 擬南芥,差異顯著(P<0.05).過表達miR408 擬南芥顯著下降 54.23 % (P<0.05). 表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 SOD 酶活性降低,而過表達miR408 基因擬南芥進一步降低 SOD 酶活性降低,從而影響植物自我修復,影響植物生長.

    圖4 擬南芥各處理組 SOD 酶活性的變化Fig.4 Changes of SOD content in Arabidopsis treatment groups

    由圖 5A 可知,正常光照下,野生型植株 GSH 含量高于過表達miR398 擬南芥(P<0.05). UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥 GSH 含量顯著下降 42.86 % (P<0.05),過表達miR398 擬南芥顯著下降 50 % (P<0.05).表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 GSH 含量減少,而表達miR398 基因的擬南芥進一步降低 GSH 含量,細胞清除活性氧自由基的能力下降,降低植物防御能力.由圖 5B 可知,野生型植株 GSH 含量高于過表達miR408 擬南芥(P<0.05).UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥 GSH 含量顯著下降 42.86 % (P<0.05),而過表達miR408 擬南芥顯著下降 47.62 % (P<0.05).表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 GSH 含量減少,而過表達miR408擬南芥降低 GSH 含量,細胞清除活性氧自由基的能力下降,氧自由基的積累不利于植物的生長.

    圖5 擬南芥各處理組 GSH 含量的變化Fig.5 Changes of GSH content in Arabidopsis treatment groups

    2.3 增強 UV-B 輻射對擬南芥各處理組中丙二醛含量的影響

    植物在逆境脅迫下受到損害,這與活性氧積累導致植物膜脂的過氧化作用相關,而作為膜脂過氧化產(chǎn)物之一 MDA,其含量的變化可以反映膜系統(tǒng)受損程度.由圖 6A 可知,正常光照下,野生型植株與過表達miR398 擬南芥中 MDA 含量無顯著差異(P>0.05).UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥 MDA 含量顯著上升 6.71 % (P<0.05),過表達miR398 擬南芥顯著上升 12.41% (P<0.05).表明 UV-B 脅迫導致擬南芥 MDA 含量升高,膜脂過氧化程度加深,而過表達miR408 擬南芥增加 MDA含量,損傷細胞膜.由圖6B 可知,正常光照下,野生型植株低于過表達miR408 擬南芥中 MDA 含量(P<0.05).UV-B 輻射處理后,野生型擬南芥 MDA 含量顯著上升 8.28 % (P<0.05),過表達miR408 擬南芥顯著上升 65.52 % (P<0.05).表明 UV-B 脅迫會導致擬南芥 MDA 含量升高,活性氧積累,膜脂過氧化程度加深,而過表達miR408 擬南芥的 MDA 含量增加,MDA大量積累對植物造成不可修復的傷害.

    圖6 擬南芥各處理組 MDA 含量的變化Fig.6 Changes of MDA content in Arabidopsis treatment groups

    結(jié)果表明,UV-B 脅迫造成了擬南芥幼苗的 SOD酶活性、GSH 含量降低,MDA 含量上升,活性氧積累,而過表達miR398 和miR408 會進一步增加 UV-B 脅迫下的活性氧含量,降低植物清除氧自由基的能力,影響植物抵抗輻射逆境脅迫,損害植株生長發(fā)育過程.

    3 討論與結(jié)論

    近年來,由于臭氧層減薄導致到達地表的 UV-B 輻射增強影響了植物正常生長,使得農(nóng)作物產(chǎn)量減少[26].增強UV-B 輻射對植物的光合能力下降、抗氧化系統(tǒng)及 DNA 造成不同程度的損傷.強烈的紫外輻射還可破壞植物葉片中的葉綠體超微結(jié)構,光合色素合成受到抑制,最終導致光合速率的下降,影響植物生長發(fā)育[27].研究發(fā)現(xiàn),受 UV-B 輻射脅迫的野生型擬南芥與正常光下的擬南芥相比,葉綠素的熒光動力學參數(shù)Fv/Fm值下降,光能轉(zhuǎn)化率降低,qN非光化學淬滅系數(shù)升高,植物耗散過剩光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力增強,qP造成 PSⅡ電子傳遞活性下降,這表明 UV-B 脅迫嚴重影響植物的光合作用過程,光合速率下降.此外,在 UV-B 脅迫等非生物脅迫下,植物體會產(chǎn)生大量活性氧,活性氧對細胞組織和生物大分子具有攻擊性,少量活性氧可以作為激起植物脅迫響應和防御反應的信號分子,但過量活性氧容易造成細胞損傷.本研究發(fā)現(xiàn),受 UV-B 輻射脅迫的野生型擬南芥與正常日光下的擬南芥相比,植物體內(nèi) SOD 酶活性降低,GSH 含量降低,過氧化產(chǎn)物 MDA 含量上升.這表明 UV-B 脅迫使得 SOD 酶活性降低和 GSH 含量減少,植物體內(nèi)清除氧自由基的能力下降,造成了擬南芥體內(nèi)活性氧的積累,最終導致膜脂過氧化程度加深,損傷細胞膜,影響植物生長.前人研究發(fā)現(xiàn) UV-B 輻射脅迫通過對植株體中光受體的影響,致使光信號導入細胞核[28],在相關作用元件下 miRNAs 表達發(fā)生改變,影響了植物的生長發(fā)育及器官形成等[29,30].此過程中,miRNAs 的表達模式響應了 UV-B 輻射脅迫.miR398 和miR408 受多種逆境脅迫誘導并參與多種脅迫的調(diào)控,如干旱、高鹽、重金屬脅迫等[3~5,7].

    本研究發(fā)現(xiàn)miR398 和miR408 均響應 UV-B 輻射脅迫.過表達miR398 和miR408 會進一步降低 UV-B 脅迫下的葉綠素熒光動力學參數(shù)Fv/Fm、qP、增加qN,降低光合作用效率,影響植株生長發(fā)育.此外,過表達miR398 和miR408 擬南芥增加 UV-B 脅迫下活性氧含量,降低植物清除氧自由基的能力,影響植物抵抗輻射逆境脅迫,損害植株生長發(fā)育過程.這表明過表達miR398 和miR408 的擬南芥植株抗逆性更差,但miR398 和miR408對 UV-B 脅迫應答機制還不完善,有待進一步研究.

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