市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

摘要 [目的]通過(guò)對(duì)石河子地區(qū)市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性的分析，評(píng)估該區(qū)域鮮牛奶的安全性。[方法]采用稀釋涂平板法分離金黃色葡萄球菌，結(jié)合接觸酶、兔血漿凝固酶試驗(yàn)，nuc基因擴(kuò)增，16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。同時(shí)，選用K-B紙片法測(cè)定分離菌株的耐藥性。[結(jié)果]從10份樣品中分離得到金黃色葡萄球菌16株。其中，47.8%的菌株表現(xiàn)為多重耐藥，12株金黃色葡萄球菌對(duì)頭孢他啶具有耐藥性。[結(jié)論]樣品中金黃色葡萄球菌多重耐藥性嚴(yán)重，應(yīng)該采取相應(yīng)的措施加以監(jiān)管。

關(guān)鍵詞 牛奶；金黃色葡萄球菌；分離鑒定；耐藥性

中圖分類號(hào) TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）27-0173-03

Isolation， Identification and Antibiotic Resistance Analysis of Staphylococcus aureus in Commercially Available Fresh Milk

GAO Xuan

（Agricultural Products Quality and Safety Testing Center of Midong District， Urumqi， Xinjiang 830000）

Abstract [Objective]Through the analysis of the isolation，identification and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus from commercial available fresh milk in Shihezi area， the safety of fresh milk in the region was evaluated. [Method]Staphylococcus aureus was isolated by dilution plate method and catalase test and coagulase test， nuc gene amplification and 16S rRNA gene sequencing were performed. At the same time， the KB disk method was used to determine the antibiotic resistance of the isolates. [Result]Sixteen strains of Staphylococcus aureus were isolated from 10 samples. Among them， 47.8% of the strains showed multidrug resistance， and 12 strains of Staphylococcus aureus were resistant to ceftazidime. [Conclusion] Staphylococcus aureus in the sample has serious multidrug resistance， and appropriate measures should be taken to supervise and administrate it.

Key words Milk；Staphylococcus aureus；Identification；Antibiotic resistance

作者簡(jiǎn)介 高璇（1988—），女，山東金鄉(xiāng)人，助理農(nóng)藝師，從事農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)研究。

收稿日期 2018-05-20

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在自然界中廣泛存在，可以產(chǎn)生多種毒素和酶，致病性很強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，近年來(lái)由金黃色葡萄球菌引起的細(xì)菌性感染占第二位，僅次于大腸桿菌[1]。同時(shí)，在不清潔的環(huán)境中金黃色葡萄球菌頻繁地污染食品，如肉、禽、蛋、奶及其制品，從而引起多種感染，包括皮炎、胃腸炎和中毒性休克綜合征等[2]。金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生高溫滅菌不能破壞的腸毒素，可對(duì)人體造成危害[3]。作為食源性致病菌，金黃色葡萄球菌的耐藥問(wèn)題也已成為影響公共衛(wèi)生的重大難題[4-5]。我國(guó)奶牛專業(yè)型的大規(guī)?；B(yǎng)殖相對(duì)較少，尤其在游牧民族聚居的地方主要以小規(guī)模的方式自由散養(yǎng)。非專業(yè)型的養(yǎng)殖大部分圈舍衛(wèi)生條件差，擠奶方式、規(guī)律不科學(xué)，很容易引起奶牛乳房被金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等感染，導(dǎo)致奶?；既榉垦?。奶牛乳房炎往往引起奶牛泌乳減少或者停止，甚至結(jié)束奶牛的產(chǎn)乳生涯。青霉素、鏈霉素、紅霉素、氯霉素等抗生素常常用于奶牛乳房炎的治療。長(zhǎng)期使用相同的抗生素會(huì)引起耐藥性微生物的富集，并且在人、奶牛、牛奶之間循環(huán)傳播[6]。近幾年，不同的“超級(jí)細(xì)菌”不斷被發(fā)現(xiàn)，由其引起的感染性疾病嚴(yán)重威脅人類健康[7]。因此，牛奶、牛乳房炎來(lái)源的病原微生物及其耐藥性引起了廣大學(xué)者的關(guān)注[8-10]。筆者對(duì)石河子地區(qū)市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌進(jìn)行分離、鑒定及耐藥性分析，掌握牛奶中金黃色葡萄球菌的分布及菌株耐藥性，為牛奶安全性評(píng)估及抗生素的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增試劑及引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；其他分析或生物純化學(xué)試劑購(gòu)自Solarbio公司；抗生素紙片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Tprofessional PCR儀，德國(guó)Biometra公司；PowerPac Universal水平電泳儀、Gel Doc TM XR凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；Fresco21型離心機(jī)，德國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集。

從市場(chǎng)散售儲(chǔ)奶桶中無(wú)菌移取50 mL樣品于100 mL滅菌離心管，編號(hào)、封口后置于冷藏盒中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.3.2 分離純化。

參考文獻(xiàn)[11]，移取25 mL均勻的牛奶樣品置于裝有225 mL無(wú)菌生理鹽水的錐形瓶中，150 r/min振蕩混勻10 min，制成10-1梯度的樣品稀釋液，移取1 mL稀釋液用裝有9 mL滅菌生理鹽水的試管進(jìn)行稀釋，得到10-2梯度稀釋液。原液、10-1、10-2這3個(gè)梯度移取200 μL均勻涂于Baird-Parker平板，37 ℃倒置培養(yǎng)36 h。挑取表面光滑、凸起、濕潤(rùn)、菌落直徑為2～3 mm，顏色呈灰黑色至黑色，有光澤，邊緣淺色，用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感特征的單菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化3次后，在營(yíng)養(yǎng)肉湯中補(bǔ)充25%的無(wú)菌甘油保藏于-80 ℃超低溫冰箱。

1.3.3 接觸酶及兔血漿凝固酶試驗(yàn)。

挑取純化后的單菌落溶于3%的H2O2溶液中，1 min內(nèi)產(chǎn)生氣泡，則為接觸酶陽(yáng)性，反之為陰性。接觸酶陽(yáng)性菌株分別接種至5 mL BHI培養(yǎng)基，36 ℃培養(yǎng)24 h，移取500 μL至細(xì)菌微量生化鑒定管（兔血漿），封口并置于37 ℃，每30 min觀察一次，直至6 h。如呈現(xiàn)凝固或凝固體積大于原體積的一半，判定為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 Nuc基因檢測(cè)。

參考Brakstad等[12]的方法，提取接觸酶、兔血漿凝固酶陽(yáng)性菌株的基因組DNA。采用特異性引物Primer 1（5′-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3′）和Primer 2（5′-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3′）對(duì)金黃色葡萄球菌的nuc基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目標(biāo)片段為267 bp。

1.3.5 16S rRNA基因擴(kuò)增、測(cè)序。

通過(guò)細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL；引物各1 μL，DNA模板50 ng，ddH2O 補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 1 min，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司純化后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用BLAST進(jìn)行在線序列同源性分析[13]。

1.3.6 耐藥性檢測(cè)。

將金黃色葡萄球菌接種至10 mL BHI培養(yǎng)基，37 ℃富集24 h。用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至（1.5～2.0）×108 CFU/mL，移取200 μL均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，將10種抗生素紙片分別等距貼于平板表面，靜置30 min，37 ℃培養(yǎng)24 h， 測(cè)定抑菌圈直徑，試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行。根據(jù)國(guó)際現(xiàn)行的臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（簡(jiǎn)稱 CLSI）[14]制定的《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》判定菌株對(duì)抗生素的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

10份鮮牛奶中分離純化得到23株疑似菌株，6份樣品檢測(cè)到金黃色葡萄球菌，檢出率為60%。其中， NN9樣品未檢測(cè)到菌株，從NN3、NN4、NN7樣品中分離的菌株接觸酶、兔血漿凝固酶試驗(yàn)均呈陰性，不符合金黃色葡萄球菌的特征。接觸酶、兔血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性菌株16株（表1）。

2.2 Nuc基因

Nuc基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，菌株NN1-3、NN5-2擴(kuò)增結(jié)果為陰性，其余14菌株為陽(yáng)性，目標(biāo)片段介于200～300 bp。

2.3 16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果

16S rRNA基因測(cè)序序列比對(duì)結(jié)果表明，16株純培養(yǎng)物均為金黃色葡萄球菌，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列的相似性為99%～100%（表1）。

2.4 金黃色葡萄球菌耐藥性

金黃色葡萄球菌耐藥性統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖2，菌株NN2-1對(duì)所測(cè)10種抗生素均敏感，25%的菌株對(duì)1～2種抗生素表現(xiàn)為耐藥，11株金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為多重耐藥（47.8%）。其中，2株菌株對(duì)6種抗生素具有耐受性，2株菌株可耐受5種抗生素。16株金黃色葡萄球菌對(duì)IMP、AMX、STR均敏感，12株菌株對(duì)CAZ耐藥，11株耐受PEN，其余抗生素耐藥性菌株為4～9株。張倩等[15]對(duì)石河子地區(qū)奶牛乳房炎源的金黃色葡萄球菌進(jìn)行了耐藥性分析，結(jié)果表明，青霉素和紅霉素耐藥率分別為71.67%、46.67%，與該研究結(jié)果（68.8%和37.5%）較為接近。

3 結(jié)論

該研究10份鮮牛奶中6份樣品共檢測(cè)到16株金黃色葡萄球菌，47.8%的菌株表現(xiàn)為多重耐藥。其中，對(duì)頭孢他啶（CAZ）和青霉素（PEN）耐藥的菌株分別為75.0%和688%。

奶牛的乳房炎嚴(yán)重影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎主要病原菌之一，由其引起的乳房炎占50%以上[16]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，飼養(yǎng)者通過(guò)長(zhǎng)期的抗生素給藥來(lái)預(yù)防奶?；既榉垦?，以此增加養(yǎng)殖效益。因此，大量的抗生素耐藥性微生物在奶牛中產(chǎn)生，并且耐藥性基因出現(xiàn)水平和垂直的傳播，多重耐藥性病原微生物富集，通過(guò)牛奶、排泄物等進(jìn)入自然環(huán)境，嚴(yán)重威脅人類健康。該研究結(jié)果表明，該區(qū)域牛奶中金黃色葡萄球菌耐藥性嚴(yán)重，尤其，對(duì)青霉素、桿菌肽等至今仍被臨床廣泛用于治療人畜感染性疾病的抗生素耐藥性菌株比例較高。由此得出，需要對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)采取一定的衛(wèi)生和抗生素管理及相關(guān)知識(shí)的普及措施，并加大對(duì)牛奶相關(guān)安全指標(biāo)的監(jiān)管力度。

46卷27期 高 璇 市售鮮牛奶中金黃色葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

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