泥鰍皮膚出血病的病原與治療研究

姜守松 唐慶權(quán) 陶敏慧 徐婷婷 毛穎睿 張子涵 魯子怡 樊慧敏 許曉牧 彭開(kāi)松 朱若林 鮑傳和 薛貴勝 李明

摘要 [目的]探明泥鰍皮膚出血病的病原，并篩選有效的外用和內(nèi)服藥物。[方法]進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定、毒力基因檢測(cè)、人工感染、藥物篩選和治療試驗(yàn)。[結(jié)果]分離的N-1、N-2和N-3株均為凡隆氣單胞菌，且攜帶氣溶素aerA、細(xì)胞毒性腸毒素Act、熱不穩(wěn)定性腸毒素Alt、絲氨酸蛋白酶Ser等毒力基因。N-1株注射泥鰍的半數(shù)致死濃度為2.2×106 CFU/尾，并復(fù)制出體表點(diǎn)狀出血癥狀。外用和內(nèi)服藥分別優(yōu)先選擇優(yōu)力克和氟苯尼考。 [結(jié)論]凡隆氣單胞菌可引起泥鰍皮膚出血病，優(yōu)力克潑灑和氟苯尼考內(nèi)服可治療該病。

關(guān)鍵詞 泥鰍；皮膚出血；凡隆氣單胞菌；優(yōu)力克；氟苯尼考

中圖分類(lèi)號(hào) S947 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）27-0088-03

Pathogen and Treatment of Skin Hemorrhage in Loach

JIANG Shousong1， TANG Qingquan2， TAO Minhui2 et al

（1. Dingyuan Water Bureau， Dingyuan， Anhui 233200；2. Laboratory of Aquatic Health and Public Health， School of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036）

Abstract [Objective]To identify the pathogen of loach skin hemorrhagic disease and screen for effective external and internal medicine. [Method]Bacterial isolation and identification， virulence gene detection， artificial infection， drug screening and treatment tests were carried out. [Result]The isolated N1， N2 and N3 strains were Aeromonas veronii and carried virulent genes such as aerolysin， cytotoxic enterotoxin， thermal unstable enterotoxin and serine protease. The median lethal concentration of N1 strain injected into loach was 2.2×106 CFU/fish， and the body surface punctate bleeding was detected. Topical and internal medication were given priority to the selection of Youlike and florfenicol respectively. [Conclusion]Aeromonas veronii can cause loach cutaneous hemorrhage， Youlike and florfenicol can be used to treat this disease.

Key words Loach；Skin hemorrhage；Aeromonas veronii；Youlike；Florfenicol

基金項(xiàng)目 安徽省重點(diǎn)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（1804g07020174）；安徽省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（皖農(nóng)科〔2016〕84號(hào)）；定遠(yuǎn)縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)推廣中心專(zhuān)項(xiàng)。

作者簡(jiǎn)介 姜守松（1973—），男，安徽定遠(yuǎn)人，工程師，從事水產(chǎn)技術(shù)推廣、水生動(dòng)物疾病監(jiān)測(cè)與防控、水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作。*通訊作者，副教授，博士，從事養(yǎng)殖健康與公共衛(wèi)生研究。

收稿日期 2018-08-23

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus），俗稱(chēng)青鰍，是鯉形目鰍科泥鰍屬的小型食用和藥用淡水魚(yú)類(lèi)，近年國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求年年攀升，是我國(guó)外貿(mào)出口的重要水產(chǎn)品之一 [1]。泥鰍耐低氧，適合高密度精養(yǎng)，但高密度養(yǎng)殖容易暴發(fā)細(xì)菌性疾病?，F(xiàn)有報(bào)道表明，可引起泥鰍疾病的細(xì)菌包括溫和氣單胞菌[2]、凡隆氣單胞菌[3]、泥鰍氣單胞菌[4]、霍亂弧菌和希瓦氏菌[5]，以氣單胞菌科成員最為常見(jiàn)。氣單胞菌科（Aeromonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas）的成員廣泛分布于水體、土壤等自然環(huán)境中，可分為致病株和非致病株，前者可感染幾乎所有動(dòng)物門(mén)類(lèi)，是淡水水生動(dòng)物的重要病原菌和重要新發(fā)人-獸-魚(yú)共患病[6-7]。

2017年8月安徽省定遠(yuǎn)縣明源水產(chǎn)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社養(yǎng)殖基地的泥鰍發(fā)生零星死亡，臨床以體表點(diǎn)狀出血為特征。為探明該病的病因和尋找防治方法，進(jìn)行了細(xì)菌的分離鑒定、毒力基因檢測(cè)、本動(dòng)物回歸攻毒、藥物篩選和治療試驗(yàn)，從而為泥鰍類(lèi)似疾病的診斷和治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥物

瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、氧化酶試紙和細(xì)菌微量生化鑒定管、藥敏紙片由杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。PCR kit由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)。DNA膠回收試劑盒由愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司生產(chǎn)。3種含碘制劑：優(yōu)力克，由嘉興綠望生物科技有限公司生產(chǎn)；迪碘，由成都科宏達(dá)科技有限公司生產(chǎn)；蛋氨酸碘，由惠州市三寶生物化學(xué)科技有限公司生產(chǎn)。抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.2 臨床診斷

對(duì)該病例發(fā)病前后的養(yǎng)殖管理、水質(zhì)情況和寄生蟲(chóng)進(jìn)行臨床診斷。

1.3 細(xì)菌純化鑒定和毒力基因檢測(cè)

3條患病泥鰍（全長(zhǎng)16～20 cm）體表消毒后，在超凈臺(tái)內(nèi)解剖，取肝胰臟截面涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂表面，接種環(huán)劃線純化細(xì)菌，28 ℃培養(yǎng)16 h，觀察菌落形態(tài)。按《弧菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊(cè)》，進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶試驗(yàn)和細(xì)菌微量生化鑒定。參照朱若林等[8]方法進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增、系統(tǒng)進(jìn)化分析和毒力基因檢測(cè)。

1.4 注射攻毒試驗(yàn)

將健康泥鰍體長(zhǎng)[（8.5±1.1）cm]養(yǎng)在曝氣自來(lái)水中，水溫28～31 ℃，進(jìn)行注射攻毒試驗(yàn)。取凡隆氣單胞菌N-1株為代表，進(jìn)行注射攻毒回歸試驗(yàn)，簡(jiǎn)化寇氏法計(jì)算LD50。設(shè)0、105、106、107、108和109 CFU/mL共6個(gè)劑量組，10尾/劑量組。試驗(yàn)期間按泥鰍攝食狀況少量投餌，不排污。觀察14 d，取瀕死泥鰍或剛死泥鰍，重新進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.5 外用和內(nèi)服藥物篩選

參考商業(yè)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 3229—2012）[9]，采用稀釋—中和法篩選外用消毒劑。參考?xì)W盟標(biāo)準(zhǔn)[10]，采用紙片法和微量肉湯稀釋法進(jìn)行內(nèi)服抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)。

1.6 治療試驗(yàn)

根據(jù)“1.5”中篩選出的有效外用和內(nèi)服藥物，進(jìn)行治療。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床診斷

發(fā)病池水溫28～30 ℃，水質(zhì)分析各項(xiàng)指標(biāo)良好?；荐q體表和鰭基部有紅色小點(diǎn)，鰭條末梢發(fā)白和腐蝕。剖檢見(jiàn)患鰍貧血，肝胰腺發(fā)白、脆爛如泥、脾臟暗紅，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲(chóng)。

2.2 細(xì)菌的純化鑒定和毒力基因檢測(cè)

從3尾患鰍肝胰臟分別分離純化得3株優(yōu)勢(shì)菌，并分別命名為N-1、N-2和N-3株。純化菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)16 h后，菌落圓形凸起、乳白色、表面光滑、邊緣整齊。3株分離菌均為革蘭氏陰性菌，且氧化酶、賴(lài)氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶均為陽(yáng)性，葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵蔗糖、甘露醇、水楊苷、枸櫞酸鹽均為陽(yáng)性，6% NaCl胨水陰性。根據(jù)編碼鑒定手冊(cè)可判定3株細(xì)菌均疑似為凡隆氣單胞菌，但鑒定值僅為57.08%。分子鑒定顯示，3株菌的16S rDNA與凡隆氣單胞菌的相似性最大，且均大于98%，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1。綜上，可確定N-1株、N-2株、N-3株均為凡隆氣單胞菌。從凡隆氣單胞菌N-2中可檢出氣溶素aerA、細(xì)胞毒性腸毒素Act、熱不穩(wěn)定性腸毒素Alt、絲氨酸蛋白酶Ser這4種毒力基因；凡隆氣單胞菌N-1株和N-3株還可檢出彈性蛋白酶ahyB（圖2）。從基因水平可知，分離株均為致病性氣單胞菌。

2.3 本動(dòng)物注射攻毒試驗(yàn)

試驗(yàn)?zāi)圉q在攻毒后3～7 d相繼發(fā)病，死亡泥鰍主要表現(xiàn)為皮膚點(diǎn)狀出血、鰭條腐蝕等癥狀。N-1株對(duì)試驗(yàn)?zāi)圉q的LD50為2.2×106 CFU/尾。人工感染發(fā)病泥鰍肝臟分離菌經(jīng)檢測(cè)為攻毒所用菌株。

2.4 有效藥物篩選

對(duì)市場(chǎng)上比較認(rèn)可的3種含碘制劑（優(yōu)力克、迪碘和蛋氨酸碘）進(jìn)行了非清潔條件和清潔條件下的最小抑菌濃度試驗(yàn)。3種碘制劑效價(jià)比以?xún)?yōu)力克最高，且考慮優(yōu)力克能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，后續(xù)治療試驗(yàn)中選擇優(yōu)力克。

紙片法測(cè)定的3株菌對(duì)14種抗菌藥物的敏感性結(jié)果如表1所示。微量肉湯稀釋法測(cè)定的最小抑菌濃度見(jiàn)表2。綜上結(jié)果，首選國(guó)標(biāo)漁藥中的氟苯尼考。

2.5 治療效果

根據(jù)上述結(jié)果，采用優(yōu)力克（濃度為0.25～0.50 mL/m3）全池潑灑，2～3次，每次間隔1 d。氟苯尼考（5 mg/kg體重，相當(dāng)于10倍的體外最小抑菌濃度）伴飼料內(nèi)服，連續(xù)用7 d，2次/d，治療效果良好。內(nèi)服拌料時(shí)，添加適量漁用多維、維生素C、清熱解毒類(lèi)和疏肝利膽的中草藥，治療效果更好。

3 討論

在泥鰍養(yǎng)殖過(guò)程中，皮膚相關(guān)疾病是養(yǎng)殖泥鰍的多發(fā)病，一般最開(kāi)始表現(xiàn)為多發(fā)性點(diǎn)狀出血病，如不及時(shí)治療會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為赤皮、腐皮、潰爛、爛鰭等。而引起這些癥狀的細(xì)菌以氣單胞菌科成員最為常見(jiàn)[2-4]。 氣單胞菌一般被認(rèn)為是條件致病菌，環(huán)境不良、肝膽綜合征、應(yīng)激等均可誘發(fā)氣單胞菌[6]。該案例中泥鰍有不同程度的肝臟綜合征（以貧血、肝胰腺蒼白和脆爛為特征），是凡隆氣單胞菌繼發(fā)感染的誘因。此次分離菌均檢測(cè)出氣溶素，其具有溶血活性，可引起出血癥狀[11]。氣溶素的檢出，可解釋臨床所見(jiàn)的出血癥狀。

凡隆氣單胞菌不僅可以感染水生和陸生動(dòng)物，還可以引起人的腹瀉、筋膜潰爛、菌血癥、肺炎、腦膜炎[12]。因此，泥鰍的食品安全問(wèn)題應(yīng)引起重視。

國(guó)內(nèi)外研究均顯示，氣單胞菌的耐藥性日益嚴(yán)重，因此處理臨床病例時(shí)，需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，才能科學(xué)用藥[13]。在治療中務(wù)必要重視泥鰍的原發(fā)病，該研究分離的病原菌毒力并不強(qiáng)，是繼發(fā)的細(xì)菌感染，而原發(fā)病是多種原因引起的脂肪肝綜合征。該治療試驗(yàn)也表明，根據(jù)藥敏試驗(yàn)篩選有針對(duì)性的藥物，配合保肝清熱等中藥治療，療效良好。

參考文獻(xiàn)

[1] 易少奎.我國(guó)泥鰍屬魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)發(fā)育、群體結(jié)構(gòu)及其適應(yīng)性進(jìn)化研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[2] 張志強(qiáng)，李永慧，吳同壘，等.致泥鰍點(diǎn)狀出血征溫和氣單胞菌的分類(lèi)鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2017，37（6）：1070-1076.

[3] 袁雪梅，姚嘉赟，藺凌云，等.泥鰍致病性維氏氣單胞菌的分離與鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，30（ 5）：730-737.

[4] 房海，陳翠珍，張曉君，等.泥鰍氣單胞菌感染的檢驗(yàn)與分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2006，22（11）：1065-1069.

[5] 林鋒，劉莉，包成榮，等.患體表出血癥的泥鰍病原菌的鑒定與生物特性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，44（3）：367-372.

[6] 彭開(kāi)松，佘銳萍，楊玉榮，等.雞β-防御素13對(duì)尼羅羅非魚(yú)生長(zhǎng)和疾病抗性的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2009，39（5）：432-436.

[7] JANDA J M，ABBOTT S L.The genus Aeromonas：Taxonomy，pathogenicity，and infection[J].Clinical microbiology reviews，2010，23（1）：35-73.

[8] 朱若林，馬騰，陳露，等.鳙魚(yú)維氏氣單胞菌的分離鑒定及其毒力基因檢測(cè)[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，44（2）：229-233.

[9] 姜英輝，房保海，祝素珍，等.食品消毒劑和防腐劑殺菌效果評(píng)價(jià)方法：SNT 3229—2012[S].中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，2012.

[10] 劉玉慶，李璐璐，駱延波，等.EUCAST歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[M].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[11] DEGIACOMI M T，IACOVACHE I，PERNOT L，et al.Molecular assembly of the aerolysin pore reveals a swirling membraneinsertion mechanism[J].Nature chemical biology，2013，9（10）：623-629.

[12] BHOWMICK U D，BHATTACHARJEE S.Bacteriological，clinical and virulence aspects of Aeromonasassociated diseases in humans[J].Polish journal of microbiology，2018，67（2）：137-149.

[13] PIOTROWSKA M，POPOWSKA M.The prevalence of antibiotic resistance genes among Aeromonas species in aquatic environments[J].Annals of microbiology，2014，64（3）：921-934.