大蒜鱗芽組培再生體系建立方法研究

吐?tīng)栠d娜依·迪力夏提 劉旭新 石強(qiáng)

[摘要]以山東和新疆白皮大蒜栽培品種為材料，建立了大蒜鱗芽為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)再生體系。采用MS培養(yǎng)基，通過(guò)激素配比篩選試驗(yàn)，比較快速誘導(dǎo)愈傷組織激素配比與方案，為供試大蒜品種脫病毒苗的快速繁殖奠定了基礎(chǔ)。篩選得到愈傷組織快速誘導(dǎo)與生長(zhǎng)培養(yǎng)基與激素配比，結(jié)果表明：快速誘導(dǎo)愈傷組織最佳激素組合為：NAA 0.5mg/L+2，4-D 1.25mg/L+MS，愈傷組織繼代生長(zhǎng)與幼苗分化激素組合為：6BA 5mg/L+NAA0.3mg/L，環(huán)境溫度25℃，光照16小時(shí)，8小時(shí)黑暗條件；所有這些結(jié)果為大蒜脫毒再生苗提純復(fù)壯與轉(zhuǎn)基因研究體系的建立都很有幫助。

[關(guān)鍵詞]大蒜；組織培養(yǎng)；再生體系

[中圖分類(lèi)號(hào)]S633.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

大蒜（Allium sativum L.）為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，是因其具有獨(dú)特的風(fēng)味和良好的藥用價(jià)值而全球性食用并種植的蔬菜。我國(guó)栽培歷史已達(dá)兩千多年，是世界最大的大蒜種植國(guó)，全國(guó)各地都有栽培。栽培大蒜由于花器官敗育，不能通過(guò)有性生殖形成種子，所以在生產(chǎn)中都是通過(guò)無(wú)性繁殖進(jìn)行生產(chǎn)。大蒜在栽培過(guò)程中，常年無(wú)性繁殖過(guò)程使其出現(xiàn)容易染病毒、品種退化等問(wèn)題，最終導(dǎo)致質(zhì)量及產(chǎn)量下降，大家通常利用組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)進(jìn)行大蒜組織脫毒，脫毒的分生組織再分化成無(wú)毒幼苗，這已經(jīng)成為提升大蒜品質(zhì)的一個(gè)手段。目前脫毒組織培養(yǎng)技術(shù)，已建立了以莖尖、根尖，真葉、貯藏葉、莖盤(pán)切塊、花序軸頂端分生組織，花藥和花原始體等為外植體的多種大蒜組織培養(yǎng)再生體系。各種外植體與其分化再生效果都有差異，本實(shí)驗(yàn)利用大蒜鱗芽作為外植體選用不同植物激素之間優(yōu)化配比，對(duì)大蒜愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行試驗(yàn)，研究對(duì)比提出了一種高效的大蒜組織培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步對(duì)大蒜進(jìn)行深入研究，如大蒜脫毒愈傷組織快速誘導(dǎo)到再生植株的成功分化，以及建立大蒜轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體系，做一些基礎(chǔ)工作，得到了比較好的再生體系模式。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料是山東白皮大蒜（產(chǎn)地山東）和新疆白皮大蒜（吉木薩爾縣），從新疆昌吉市市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的當(dāng)年新蒜。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)條件?；九囵B(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基（M&S M519，Phytotechnology公司產(chǎn)品）含蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH值5.8，在培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光強(qiáng)4000～5000lux培養(yǎng)于光照24h/d。植物激素采用2，4-D，6BA，2IP，NAA等（SIGMA公司產(chǎn)品）。

1.2.2 外植體準(zhǔn)備。取無(wú)病無(wú)霉變的大蒜瓣放入清水中浸泡l0min，然后用無(wú)菌水沖凈，在超凈臺(tái)上將大蒜瓣橫切成2段，將有鱗芽的一段放入培養(yǎng)皿，切開(kāi)剝出鱗芽，切2～3塊，10%的次氯酸鈉溶液中浸泡2min，后用無(wú)菌水沖洗3～5次。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。將外植體接種在添加不同濃度配比激素組合（共42個(gè)處理）的MS培養(yǎng)基上，每瓶接種10個(gè)外植體，每個(gè)處理4～5瓶，接種15d后開(kāi)始觀察及統(tǒng)計(jì)直徑超過(guò)3mm的愈傷組織。40d后繼代培養(yǎng)一次，使用相同的培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)1～2次。

1.2.4 數(shù)據(jù)記錄與處理。 經(jīng)不同配比的激素組合處理的大蒜鱗芽愈傷組織，不定芽和生根情況各在培養(yǎng)40d和20d后開(kāi)始進(jìn)行記錄。通過(guò)目測(cè)法觀測(cè)不同激素配比對(duì)大蒜鱗芽組織培養(yǎng)的影響，觀察記錄愈傷組織發(fā)生率來(lái)計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率，統(tǒng)計(jì)方法如下式所示：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比處理對(duì)大蒜鱗芽愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以MS固體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基進(jìn)行生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的不同配比組合（共42個(gè)處理，激素配比與組合見(jiàn)表1），研究不同組合對(duì)大蒜鱗芽愈傷組織誘導(dǎo)率影響的試驗(yàn)。大蒜愈傷組織在誘導(dǎo)培養(yǎng)20d左右開(kāi)始出現(xiàn)，可以從外植體的一端或兩端或者整個(gè)外植體上產(chǎn)生，25d左右達(dá)到計(jì)數(shù)水平。經(jīng)觀察計(jì)數(shù)得到各處理對(duì)大蒜鱗芽愈傷組織誘導(dǎo)率影響結(jié)果如表l。

當(dāng)2，4-D濃度為1mg/L時(shí)，大蒜鱗芽誘導(dǎo)率隨NAA濃度的增加而降低；當(dāng)NAA濃度為0.5mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率隨2，4-D濃度的增加而增加，但2，4-D濃度超過(guò)1.25mg/L開(kāi)始誘導(dǎo)率反而不再上漲。當(dāng)2iP濃度為0.1mg/L時(shí)2，4-D濃度為1.5mg/L時(shí)的山東大蒜鱗芽愈傷組織和2，4-D濃度為2mg/L時(shí)的新疆大蒜鱗芽愈傷組織誘導(dǎo)率效果最好。

2.2 不同處理愈傷組織幼芽分化誘導(dǎo)的影響

大蒜愈傷組織成功誘導(dǎo)出來(lái)后，選定不同濃度配比的激素（6BA）繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，能成功誘導(dǎo)分化出幼芽（圖1），但是大蒜愈傷組織誘導(dǎo)成芽需要更長(zhǎng)時(shí)間（表2）。

3 結(jié)論

本研究綜合考慮大蒜鱗芽組織愈傷組織形成率和周期等關(guān)鍵因素，從控制誘導(dǎo)與分化的角度篩選最佳植物激素組合的培養(yǎng)基，有利于大蒜鱗芽組培再生技術(shù)的推廣應(yīng)用。單子葉植物轉(zhuǎn)化體系往往采用農(nóng)桿菌攜帶目的基因轉(zhuǎn)化愈傷組織，通過(guò)抗性篩選得到轉(zhuǎn)化植株，所以此實(shí)驗(yàn)不僅對(duì)大蒜深入進(jìn)行生物工程研究打下基礎(chǔ)，而且對(duì)大蒜轉(zhuǎn)基因體系的建立都具有重要應(yīng)用價(jià)值。

4 展望

隨著生物技術(shù)手段的不斷豐富，組織培養(yǎng)技術(shù)作為重要的技術(shù)手段，為人類(lèi)科學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展提供了強(qiáng)大的支撐，而大蒜的組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)的完善使蒜苔和鱗莖產(chǎn)量有所增加，高產(chǎn)量及質(zhì)量的目的達(dá)到了。然而脫毒植株在實(shí)際應(yīng)用中可能再度感染，加之試管繁殖系數(shù)尚低，因而規(guī)模化生產(chǎn)技術(shù)還需進(jìn)一步研究。而將現(xiàn)代生物技術(shù)納入大蒜植物的遺傳改良和育種程序，將會(huì)加速培育出高品質(zhì)、高抗逆性、更有應(yīng)用價(jià)值的新品種，以滿(mǎn)足人們生活水平不斷提高的需求。

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