植物組織培養(yǎng)中污染防控方法研究

張朕 馬艷麗

摘 要：植物組織培養(yǎng)在植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實施、植物繁殖、新品種培育中具有重要意義，但植物組織培養(yǎng)中極易發(fā)生植物材料污染，致使科研和生產(chǎn)無法進行，運行成本增加。本文通過近年的大量實驗，分析了植物組織培養(yǎng)污染發(fā)生原因，并總結(jié)了較好的防控污染方法。

關(guān)鍵詞：植物；組織培養(yǎng)；污染防控

文章編號：1004-7026（2018）01-0066-02 中國圖書分類號：Q943.1 文獻標志碼：A

植物組織培養(yǎng)是20世紀初以植物生理學為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，這項技術(shù)已在科研和生產(chǎn)中得到廣泛應用，經(jīng)過多年發(fā)展研究技術(shù)已相對成熟。但是在組培過程中仍易發(fā)生污染，致使科研和生產(chǎn)成本增加。項目組成員在多次組織培養(yǎng)實驗中，總結(jié)出如下組織培養(yǎng)污染防控方法。

1 組培環(huán)境無菌防控

在進行組織培養(yǎng)之前，首先要建立組培實驗室。實驗室包括準備室、無菌操作室（接種室）和培養(yǎng)室。植物組織培養(yǎng)是一種要求做到無菌操作和無菌培養(yǎng)的技術(shù)，這種技術(shù)有兩個個主要目的：一是防止實驗室的培養(yǎng)物被外來微生物，如皮膚、衣服或周圍環(huán)境中的微生物污染；二是防止實驗工作者被微生物感染。組培環(huán)境中造成污染影響的因素主要是室內(nèi)空氣中漂浮的細菌和真菌孢子，因此我們在實驗之前都會對接種環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境進行滅菌處理。包括每次接種前都要用紫外線滅菌燈對接種環(huán)境和無菌操作臺進行15分鐘照射，并用75%酒精擦拭無菌操作臺和接種人雙手；接種時一旁點燃酒精燈，并使玻璃罩門開到僅夠?qū)嶒炄藛T伸入雙手接種程度即可。

2 外植體消毒

外植體因生長環(huán)境的原因，使其表面會帶有細菌，同時外植體的內(nèi)生細菌也會造成組織培養(yǎng)的污染，為此，適宜采取以下防控措施：

2.1 外植體表面消毒處理

將外植體先用洗衣粉或者肥皂水浸泡30分鐘，然后用清水清洗。將外植體移至無菌室用75%酒精浸泡10～15s，用無菌水沖洗2～3遍，再用0.1%升汞浸泡10min，倒出后用無菌水沖洗3遍，才可以進行接種。

2.2 外植體內(nèi)生細菌的殺菌處理

2.2.1 多次消毒（滅菌）。先用飽和香皂水對外植體浸泡20～30min，再用0.1%高錳酸鉀溶液處理5min，然后用4%次氯酸鈉加0.1%升汞消毒，最后用500mg/L先鋒霉素或羧芐青霉素的無菌水洗，都取得了理想的消毒效果，可使污染率降低50%[1]。

2.2.2 使用混合的消毒液消毒。對于乳汁等分泌物較多的外植體用含聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸、抗壞血酸、多菌靈、氨芐青霉素或氯霉素的混合液預處理，既可減少酚和乳汁的分泌，也減少了污染。

3 操作過程中污染防控措施

3.1 實驗器材滅菌

實驗器材包括各種玻璃材質(zhì)的培養(yǎng)器皿如：培養(yǎng)皿，錐形瓶等，和各種鐵質(zhì)的接種用具如：鑷子，剪刀，接種用刀等。

3.1.1 培養(yǎng)器皿滅菌。培養(yǎng)器皿多為玻璃材質(zhì)，在使用前清洗干凈并放入烘箱中采取干熱滅菌法進行滅菌，以備培養(yǎng)基配制和接種實驗使用。

3.1.2 接種用具滅菌。接種用具多為鐵質(zhì)，所以可以采取灼燒法滅菌。接種時接種用刀和鑷子等在進行多次使用后，放在酒精燈外焰上進行灼燒，達到滅菌目的，避免因接種用具上沾染細菌造成感染。

3.2 實驗藥劑滅菌

實驗藥劑配制完成后要進行滅菌處理，多采用高壓蒸汽滅菌法對接種所用培養(yǎng)基進行滅菌：將配制好的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)所用經(jīng)過滅菌處理的培養(yǎng)皿中并封口，放入高壓蒸汽滅菌鍋中進行高壓蒸汽滅菌。注意滅菌后不宜馬上打開高壓蒸汽滅菌鍋，防止因培養(yǎng)皿內(nèi)外氣壓引起培養(yǎng)皿封口膜被氣壓頂開。

4 其他污染防控方法

組培過程中可以在培養(yǎng)基中加入抗生素和抑菌劑來達到抑制細菌生長，控制污染的目的。

4.1 加入殺菌劑

組培污染病原菌主要為細菌和霉菌，以及少量酵母菌和放線菌。抗生素往往只對細菌或霉菌有抑 （殺）作用：一般用于防治病害的化學農(nóng)藥等主要抑 （殺）霉菌，有些對細菌也有抑制作用；化學防腐劑往往對細菌和霉菌都有抑（殺）作用。因此，單一殺菌劑防制組培污染一般效果較差，并且容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此可以考慮加入多種殺菌劑[2]。

4.2 加入抗生素

我們選擇孔雀竹芋、天鵝絨竹芋、馬鈴薯、山藥、甘薯做接種的植物材料，抗生素選用硫酸慶大霉素、氯霉素，以及殺菌劑愛力克，其中加入愛力克全部培養(yǎng)基未經(jīng)過高壓蒸汽滅菌，培養(yǎng)基配方共9種（見表1）。15天后觀察污染情況。未加入抗生素的孔雀竹芋5個配方平均污染率為35%、天鵝絨竹芋27.5%、馬鈴薯75%、山藥25%、甘薯55%；加入抗生素的孔雀竹芋5個配方平均污染率為4.38%、天鵝絨竹芋5.00%、馬鈴薯6.25%、山藥6.25%、甘薯3.125%。

4.3 嚴格控制環(huán)境和外植體消毒

鑒于第一次接種污染率過高，在對接種環(huán)境和外植體消毒條件進行嚴格把控后進行第二次接種實驗。接種環(huán)境消毒包括接種前使用紫外線燈照射30min，同時打開臭氧發(fā)生器并保證接種全程使其處于工作狀態(tài)。外植體消毒更加嚴格每次使用酒精和升汞消毒少量外植體，少量多次消毒，保證消毒過的外植體會立刻完成接種。

通過實驗數(shù)據(jù)可以看出，在相同接種情況下加入抗生素可以極大程度上降低外植體的污染率，其中加入愛力克的培養(yǎng)基甚至未經(jīng)過高溫高壓滅菌器污染率依然低于正常培養(yǎng)基。并且嚴格控制接種環(huán)境和外植體消毒同樣可以達到降低外植體污染率的目的。

5 實驗結(jié)論

導致植物組織培養(yǎng)污染原因可歸結(jié)為3個方面：一是組織培養(yǎng)室或接種室的清潔問題；二是外植體自身帶菌；三是組織培養(yǎng)過程各環(huán)節(jié)操作不適宜或不嚴格。

但實驗中發(fā)現(xiàn)外植體交叉污染現(xiàn)象較為普遍，所以控制住外植體交叉污染情況同樣可以做到降低污染率的目的。

某些外植體如馬鈴薯，甘薯，山藥等的表皮不易消毒，在組培中選擇正確的外植體和消毒方式也是降低污染率的重要措施。

待解決問題：實驗過程中發(fā)現(xiàn)，在同樣培養(yǎng)時間和培養(yǎng)條件下，外植體在加入抗生素的培養(yǎng)基中的愈傷組織發(fā)生數(shù)量明顯低于未加入抗生素培養(yǎng)基上愈傷組織的發(fā)生數(shù)量。

參考文獻：

[1]周鵬，鄭學勤，陳向明.成齡番木瓜的快繁技術(shù)[J].熱帶作物學報，1995，16（2）：66-69.