母豬頭胎乳頭利用時間是否影響第二胎乳腺組織的泌乳量和基因表達

周琳

摘 要：最近的研究表明，母豬在第一胎中未被仔豬吮吸利用的乳頭在第二胎中會發(fā)育不良且泌乳量下降。本研究將研究在首個泌乳期中母豬乳頭分別吮吸2 d、7 d和21 d對第二胎中所產(chǎn)仔豬生長性能、乳成分、母豬內(nèi)分泌和乳腺組織基因表達的影響。妊娠的頭胎大白母豬根據(jù)泌乳期分為3組：1） 泌乳期2 d（組號“2D組”，母豬20頭）；2） 泌乳期7 d（組號“7D組”，母豬20頭）；3） 泌乳期21 d（組號“21D組”，母豬21頭）。斷奶后，母豬正常飼養(yǎng)直至第二胎。在這兩個胎次的泌乳期內(nèi)，每頭母豬的帶仔數(shù)均調(diào)整為12頭和12個功能乳頭，多余的乳頭封印處理。在第二胎的泌乳期內(nèi)，記錄母豬的采食量，同時在出生后第2、7、14、21、31和56天分別對仔豬稱重。在第二胎妊娠的第110天和泌乳期的第21天，每個處理組取10頭母豬的乳腺薄壁活體組織檢測PRL、PRLR-LF、STAT5A、STAT5B、LALBA和IGFBP-5基因mRNA豐度，同時采集乳汁和頸靜脈血液樣本，分析乳的標準組成成分（干物質(zhì)、脂肪、蛋白和乳糖），測定血液中催乳素、IGF-1、葡萄糖和尿素濃度。結(jié)果表明，在第二胎泌乳期的第1周，與2D組和7D組母豬相比，21D組母豬采食量有升高的趨勢 （P<0.10）；在第56天之前，不同處理組在仔豬體重及母豬乳汁的干物質(zhì)、脂肪、蛋白和乳糖含量上均無顯著的差異（P>0.10）。在第二胎泌乳期的第110天，21D組母豬乳腺組織的PRL表達水平高于7D組的母豬；在第21天，7D組母豬乳腺組織STAT5B的表達水平高于2D組的母豬（P<0.05），而IGFBP-5的表達水平往往低于后者（P<0.10）；2D組母豬乳腺組織LALBA的表達水平低于7D組母豬。本文研究結(jié)果表明，母豬首個泌乳期期乳頭被仔豬吮吸時間從2 d增加到7 d或21 d不會影響其第二胎所吮吸仔豬的生長速度。這說明在第一胎中讓母豬乳頭接受2 d的仔豬吮吸足以確保母豬乳腺的良好發(fā)育。

關(guān)鍵詞：基因表達；泌乳期；泌乳量；胎次；母豬；乳頭吮吸

中圖分類號：S814.7 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）04-0037-06

決定哺乳仔豬生長速度的主要因素是它們攝入的母乳量，而母豬的泌乳量又受制于啟動泌乳時乳腺中乳腺細胞的數(shù)量（Head和Williams，1991）。妊娠的最后三分之一時間是母豬乳腺快速發(fā)育的階段（S?rensen等，2002），這種發(fā)育在整個泌乳期會一直持續(xù)。有報道稱，哺乳仔豬從哺乳期的第5天到第21天，其體重平均提高57%（Kim等，1999）。在仔豬斷奶后，母豬乳腺快速萎縮，進而退化到休眠狀態(tài)（Monks等，2002）。在斷奶后的7 d中，母豬乳腺實質(zhì)組織重量會減少三分之二以上（Ford等，2003）。萎縮后，乳腺組織會在下一胎的妊娠期再次發(fā)育。

仔豬的吮吸對乳腺組織維持泌乳功能極為重要（Farme，2013），否則乳腺組織在泌乳期間也會發(fā)生萎縮（Theil等，2006）。這種萎縮在 3 d后是不可逆的，且會引起乳腺基因表達的改變。最新的研究表明，在第一胎泌乳期間未被仔豬吮吸利用的乳頭在第二胎中會出現(xiàn)發(fā)育不良且泌乳量下降。吮吸第一胎被用過乳頭的仔豬在56日齡時體重比吮吸早先未被用過乳頭的仔豬重1.12 kg（Farmer等，2012）。該最近的研究還證明，頭胎期間被吮吸過的乳頭其乳腺實質(zhì)組織中催乳素mRNA相對豐度有增高的趨勢。但仍有部分問題留有疑問：頭胎時乳頭最短需要吮吸多長時間才不會影響該乳頭在第二胎的泌乳量？本研究的目的是明確頭胎期間母豬乳頭分別接受2 d、7 d和21 d的吮吸時間對第二胎中的仔豬生長性能、內(nèi)分泌狀態(tài)和母豬乳腺組織基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗?zāi)肛i和分組

試驗選擇有14個功能性乳頭的61頭初產(chǎn)大白母豬，用長白公豬精液實施人工授精，飼喂至分娩。隨后根據(jù)泌乳期長短，61頭母豬隨機分為3組：（1） 泌乳期2 d（ 組號“2D 組”，母豬20 頭）；2） 泌乳期7 d（ 組號“7D 組”，母豬20 頭）；3） 泌乳期21 d（ 組號“21D 組”，母豬21 頭）。斷奶后，母豬按照正常生產(chǎn)流程飼養(yǎng)至第二胎分娩。在兩個胎次的泌乳期間，各母豬的帶仔頭數(shù)于分娩后12 h內(nèi)標準化到12頭（根據(jù)平均窩重調(diào)整）。在標準化時，第一胎每頭仔豬只允許吮吸1個乳頭，剩余乳頭用膠帶封隔。在第二胎的泌乳期內(nèi)中，第一胎中封隔的乳頭依舊封隔，且也不增加封隔的乳頭，即使有仔豬死亡也如此。在第二胎的泌乳期內(nèi)，仔豬在出生后48 h（窩仔豬數(shù)標準化后）、第7天、第14天和第21天（斷奶）、第31天和第56天分別稱重。仔豬在斷奶前不補充教槽料以保證其增重真實反映了母豬的泌乳量，記錄斷奶前的死亡率。在第二胎泌乳期的第21天，先將母豬與仔豬隔離45 min后，再給母豬靜脈注射1.0 mL催產(chǎn)素，隨后分別選定前、中、后三個有正常泌乳功能的乳頭人工擠奶收集豬乳樣本，測定乳中的干物質(zhì)、脂肪、蛋白和乳糖含量；同時取所有母豬的頸靜脈血液樣本，測定催乳素、胰島素樣生長因子（Insulin Like Growth Factor 1，IGF-1）、葡萄糖和尿素的濃度。

在兩個妊娠期中，母豬均飼喂常規(guī)的玉米-豆粕型商品日糧，其中粗蛋白14.3%、消化能3 266 kcal/kg、賴氨酸0.75%。頭胎母豬飼喂量為2.5 kg/d，二胎母豬飼喂量為3.0 kg/d，每天07：00飼喂1次。在兩個哺乳期中，母豬飼喂常規(guī)的玉米-豆粕型商品日糧，其中粗蛋白17.6%、消化能3 459 kcal/kg、賴氨酸1.0%，每天09：00飼喂1次。母豬在分娩當(dāng)天飼喂3 kg日糧，從分娩后第2天至斷奶期間實行自由采食。在第二胎的泌乳期，每天對余料進行稱重以計算采食量。第一胎的母豬從斷奶至配種期間自由采食相同的哺乳期飼料，哺乳母豬于妊娠期第110天轉(zhuǎn)入周轉(zhuǎn)性分娩欄內(nèi)（1.8 m×2.4 m）。斷奶時，同窩仔豬整體飼養(yǎng)在1.2 m×3.0 m的欄內(nèi)直至56日齡，期間飼喂4種商品日糧（表1），自由采食與飲水。實驗日期從2013年10月至2015年4月。

1.2 血液樣本處理與檢測

在早上喂料前采集頸靜脈血，以測定催乳素、IGF-1、葡萄糖和尿素的濃度。催乳素濃度測定參照Robert等（1989）的方法進行。直接購買標記的催乳素和催乳素的一抗抗體，檢測前確認哺乳母豬混合血液樣本的有效性，平行性和平均回質(zhì)率均為98.3%，檢測靈敏度為1.5 ng/mL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為4.47%和2.79%。購買人用IGF-1濃度檢測盒，檢測靈敏度為0.10 ng/mL，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為4.58%和1.17%。采用商品試劑盒的酶解比色法檢測葡萄糖，組內(nèi)好組間變異系數(shù)分別為1.32%和0.42%。尿素測定參照Huntington等（1984）的方法使用自動分析儀用比色法測定，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為2.58%和0.46%。

測定全奶的干物質(zhì)、蛋白、脂肪和乳糖含量。干物質(zhì)測定采用送風(fēng)定溫干燥法；蛋白采用微量凱氏定氮法重復(fù)測定；脂肪采用乙醚萃取法提??；乳糖利用商業(yè)試劑盒以比色法測定。組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為1.38%和0.71%。

1.3 乳腺活組織檢查

在第二胎的妊娠期第110天和哺乳期第21天，采集10頭母豬的功能性乳腺的薄壁組織樣本。乳腺活組織樣本檢查參照Kirkwood等（2007）的方法，與之不同的環(huán)節(jié)是母豬通過 8 mL～10 mL的麻醉預(yù)混劑和15 mL氮哌酮麻醉處理，然后每個乳頭采集50 mg組織樣本?；罱M織樣本置于含有1 mL RNAlater的2 mL管內(nèi)，4 ℃放置過夜，再于-80 ℃凍存后測定催乳素（PRL）、催乳素長型受體（PRLR-LF）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT5A和STAT5B）、α-乳白蛋白（LAIBA）和IGFBP-5的基因豐度。

1.4 RNA提取、DNA合成以及選定基因的實時PCR擴增

50 mg乳腺組織置于1 mL peq GOLD TriFast內(nèi)，采用1.0 mm玻璃珠勻漿處理，總RNA根據(jù)試劑盒說明書用Direct-zolRNA miniPrep試劑盒提取。RNA數(shù)量和純度分別在260 nm和280 nm吸收光波下用NanoDrop ND 2000分光光度計測定吸光值。cDNA反轉(zhuǎn)錄體系含0.25 μg總RNA、M-MLV反轉(zhuǎn)錄RNAaseH-、點突變和隨機六聚體引物。mRNA豐度以實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）測定，反應(yīng)體系含有SensiMix SYBR-Green、5 pmol正向引物和5 pmol反向引物。其中看家（內(nèi)參）基因（GAPDH和泛素）和待檢測靶基因均根據(jù)之前報道序列（PRL、PRLR-LF、LAIBA和IGFBP-5）人工合成。以Rotor Gene 軟件進行閾值分析，靶基因表達以內(nèi)參基因進行標準化處理，其公式如下：△Ct=Ct靶基因 - Ct內(nèi)源對照（各個內(nèi)參基因的平均Ct值）。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SAS統(tǒng)計軟件中的MIXED程序進行統(tǒng)計分析。其中激素和代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)以及乳成分和實時定量PCR數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，包括處理效應(yīng)和殘差分析。重復(fù)測量方差分析，包括處理組內(nèi)誤差（相同處理組內(nèi)母豬間的誤差）和天數(shù)（殘差誤差）以及處理組×天數(shù)對采食量和仔豬體重的協(xié)同效應(yīng)。對每天的上述變量進行獨立方差分析。不同處理組間分娩后24 h（窩標準化以后）直至斷奶期間的仔豬死亡率以非參數(shù)Wilcoxon檢驗進行對比分析。本文文中和表格內(nèi)數(shù)據(jù)除特別注明外，均以最小二乘均數(shù)±最大標準誤表示。P≤0.1作為趨勢判斷標準，P≤0.5作為顯著性差異判斷標準。

2 結(jié)果

母豬泌乳期間各周的每日平均采食量及仔豬的體重和體增重如表2所示。Repeated-in-time分析表明母豬采食量受哺乳時間的影響（P<0.001）而不同的處理組間無顯著差異（P>0.10）。每周分析結(jié)果表明，在哺乳期的第一周，21D組母豬的采食量有高于2D和7D組母豬的趨勢 （P<0.10）；不同處理的仔豬體重及增重在56日齡前無明顯差異（P>0.10）。2D、7D和21D組仔豬出生后24 h至斷奶期間的死亡率分別為6.70%、11.22%和9.52%；與2D組相比，7D組的仔豬死亡率具有升高的趨勢（P<0.10）；2D、7D和21D組窩仔豬死亡頭數(shù)分別為0.80、1.33和1.10頭。

表3所示為泌乳期第21天血液中催乳素、IGF-1、尿素和葡萄糖的濃度，不同處理間無明顯差異（表3）。此外，在泌乳期第21天，不同處理間的乳成分（干物質(zhì)、脂肪、蛋白和乳糖）含量也無明顯不同（P>0.10）（表4）。

Repeated-in-time分析顯示，在妊娠期第110天和泌乳第21天，不同處理組的母豬乳腺薄壁組織中PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B、LALBA和IGFBP-5基因的mRNA相對豐度存在顯著的采樣日效應(yīng)（P<0.01）（表5）。與泌乳期第21天相比，妊娠期第110天時的PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B和IGFBP-5表達水平更高，而LALBA則更低。在妊娠期第110天，不同處理對PRL表達水平的影響顯著不同（P=0.05），21D組母豬顯著高于7D組母豬。在泌乳期第21天，該效應(yīng)不再存在，但7D組母豬的STA5B基因表達水平高于2D組母豬（P=0.05），而IGFBP-5表達水平有低于2D組母豬的趨勢（P<0.10）。2D組母豬的LALBA mRNA豐度也出現(xiàn)了低于7D組母豬的趨勢（P<0.10）。

3 討論

早期研究結(jié)果表明，第一胎的哺乳期中沒有被啟用的乳頭會對第二胎時吮吸該乳頭的仔豬的生長產(chǎn)生不良的影響（Farm等，2012）。這就引發(fā)了在第一胎的泌乳期中乳頭必須被吮吸多少時間才不會影響第二胎的泌乳期吮吸該乳頭仔豬生長速度的疑問。本文的研究結(jié)果首次證明了第一胎中哺乳時間從2 d延長到7 d或21 d并不會提高下一個哺乳期中仔豬的生長速度。這表明在第一胎的哺乳期中乳頭持續(xù)吮吸 2 d足以使乳腺得到充分的發(fā)育和基因表達，從而在第二胎的哺乳期中不會對泌乳量產(chǎn)生不良的影響。

本研究的實驗?zāi)Ｐ筒煌贔armer等（2012）所用的模型：在本研究中，處理組是針對第一個哺乳期的所有乳腺組織，而之前研究是針對特定的乳頭。雖然仔豬吮吸按摩程度與會影響母豬泌乳量的激素狀態(tài)（如催產(chǎn)素的釋放）之間有著一定的相關(guān)性，但仔豬的斷奶體重主要還是取決于單個乳腺組織泌乳量的差異（Fraser等，1979）。實際上，每一個乳腺組織的乳合成組織獨立于其相鄰的乳腺組織，單頭仔豬的增重與其所吮吸的乳腺重量存在相關(guān)性。此外，泌乳期間乳腺發(fā)育似乎在乳腺水平上調(diào)節(jié)著。

仔豬吮吸刺激對乳腺發(fā)育和泌乳量的重要性最近才被提出。Theil等（2005）指出，泌乳早期連續(xù)3 d未被吮吸的乳腺會發(fā)生不可逆的萎縮，而1 d未被吮吸的乳腺則可以恢復(fù)但整個哺乳期的泌乳量會低于經(jīng)常性吮吸的乳腺（吮吸這些乳腺的仔豬體重會下降23%）。與經(jīng)常性被仔豬吮吸的乳腺組織相比，1 d或3 d未被仔豬吮吸的乳腺其基因的表達會改變，PRLR mRNA和LALBA mRNA被下調(diào)，而IGFBP-5 mRNA則會被上調(diào)。這些改變在被仔豬停止吮吸1 d但不是3 d的乳腺組織中是可逆的。因此，乳頭停止使用的時間對乳腺組織中乳腺基因的表達具有重要的影響。Farmer等（2012）的研究結(jié)果表明，乳頭的停止使用可能存在延滯效應(yīng)，從而對下一個哺乳期的泌乳產(chǎn)生負面影響。

研究顯示，分娩后仔豬吮吸的持續(xù)時間對于維持母豬每個乳腺組織的泌乳至關(guān)重要。當(dāng)接受短暫吮吸（如12 h～14 h）的乳腺與未被仔豬吮吸或經(jīng)常性接受吮吸的乳腺相比較時，接受短暫吮吸和未接受吮吸的乳腺組織均會發(fā)生萎縮，因此無法維持正常的泌乳功能。另一方面，在上述兩種情況下，乳腺細胞的增殖誘導(dǎo)至少需要6 d，表明12 h～14 h的吮吸時間足以使乳腺能夠維持與泌乳早期接受經(jīng)常性吮吸的乳腺組織相近的乳腺細胞增殖速度。這些發(fā)現(xiàn)非常有意義，因為它們證明了產(chǎn)后早期仔豬吮吸的一個長期效應(yīng)。同時，乳腺組織的基因表達同樣存在著重大變化：與分娩后接受經(jīng)常性吮吸的乳腺相比，未接受吮吸和短暫接受吮吸的乳腺組織中PRLR mRNA豐度降低而IGFBP-5 mRNA豐度則升高。因此，研究人員得出結(jié)論，高水平的催乳素受體轉(zhuǎn)錄和低水平的IGFBP-5轉(zhuǎn)錄對于乳腺維持泌乳功能非常重要。這與Tonner等（2000）的研究結(jié)果一致，后者報道IGFBP-5參與了引發(fā)乳腺萎縮的生理過程。本文的研究結(jié)果顯示，在第二胎的泌乳期，21D組母豬在妊娠期第110天PRL mRNA豐度增加，而2D組母豬在泌乳期第21天乳腺中IGFBP-5的基因表達水平升高。因此，仔豬吮吸的持續(xù)性對下一個胎次母豬乳腺薄壁組織的基因表達具有延滯效應(yīng)。2D組母豬在第二胎泌乳期第21天時LALBA基因的mRNA表達的下降趨勢也證實了該假設(shè)，但已觀測到對乳腺基因表達的作用還不足以引起仔豬增重的改變。

本研究關(guān)于乳腺薄壁組織中LALBA mRNA表達與Theil等和VanKlompenberg等（2013）的研究結(jié)果一致，他們報道由于乳合成能力的提高妊娠后期至泌乳早期LALBA基因表達水平大幅提高。就我們所知，本研究是首次報道妊娠后期PRL、PRLR-LF、STA5A、STA5B和IGFBP-5等基因mRNA豐度提高。Theil（2006）報道，PRLR基因表達在妊娠后期和泌乳早期之間沒有變化，而IGFBP-5的基因表達只有略微的提高。產(chǎn)生這種不一致結(jié)果的原因還不清楚，但考慮到催乳素參與了乳腺發(fā)育，且在妊娠后期啟動泌乳，當(dāng)前的研究結(jié)果并不出人意料。

本文研究結(jié)果顯示不同處理方式對乳成分組成沒有影響，這與之前的研究結(jié)果一致，即第二胎的功能性乳頭（在第一胎中不論是否被吮吸過）所分泌的乳汁在組成上均無差異（Farmer等，2012），考慮到本研究中所有乳頭在第一胎時都至少被吮吸2 d，因此乳成分不會產(chǎn)生差異。唯一一個調(diào)查在第一胎時未被吮吸的乳頭對其在第二胎中泌乳能力影響的研究沒有測定乳的成分（Fraser等，1992）。催乳素對維持母豬泌乳的重要作用已經(jīng)得到證明，在本研究中，泌乳后期血液中催乳素、IGF-1、尿素和葡萄糖的濃度沒有變化，與母豬有相近的泌乳量、乳成分組成和采食量相符合。

綜上所述，Theil等（2006）證實，分娩后前12 h～14 h的吮吸不足以啟動和維持母豬的泌乳，因此，規(guī)律性吮吸才能維持母豬的持續(xù)泌乳。但分娩后啟動泌乳所需要的最短吮吸時間沒有測定。本研究結(jié)果表明，分娩后持續(xù)48 h的規(guī)律性吮吸足以啟動母豬的泌乳過程，這樣下一個胎次的泌乳不會受到負面影響（Farmer等，2012），本文的研究結(jié)果對頭胎母豬的生產(chǎn)管理極為重要。