噬菌體在食源性病原菌防控中的應(yīng)用

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近年來(lái)，食源性疾病已逐漸成為全球食品安全的首要問題，嚴(yán)重威脅公共健康和影響經(jīng)濟(jì)發(fā)展，引起食源性疾病的主要病原菌有大腸桿菌、李斯特菌、沙門菌和彎曲桿菌等[1]。目前預(yù)防和治療該類細(xì)菌感染的首選還是抗生素，但隨著抗菌藥物的長(zhǎng)期廣泛、不合理使用后，耐藥傳播及藥物殘留等問題越來(lái)越尖銳。另一方面，由于生活方式的改變，如對(duì)新鮮食物和即食食品消費(fèi)的提高，增加了這些食源性病原菌從農(nóng)場(chǎng)到餐桌流通的風(fēng)險(xiǎn)[2]。我國(guó)致力于改善和加強(qiáng)食品安全的監(jiān)管，比如針對(duì)終端產(chǎn)品的重點(diǎn)抽查，但對(duì)食源性疾病的基礎(chǔ)設(shè)施和監(jiān)管能力仍有很大上升空間[3]。這些問題使我們不得不尋找針對(duì)食源性病原菌更加安全高效且無(wú)污染的防控手段。

噬菌體是一種能夠特異性吸附感染細(xì)菌的病毒，廣泛存在于地球上，數(shù)量可達(dá)1031左右[4]。因其獨(dú)特的裂解機(jī)制被認(rèn)為是一種抗菌物質(zhì)，但相比于抗生素而言，噬菌體具有嚴(yán)格的宿主特異性、指數(shù)增殖、數(shù)目龐大等特性受到研究人員的關(guān)注，此外研發(fā)時(shí)間短、成本低、安全無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)使得噬菌體有望成為新的抗菌工具。

美國(guó)和西方一些國(guó)家對(duì)于將噬菌體作為食源性病原菌防控手段的評(píng)估更趨完善。科研人員利用噬菌體對(duì)食品，尤其是動(dòng)物性產(chǎn)品在其養(yǎng)殖、屠宰、運(yùn)輸、儲(chǔ)備及食用過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)可能受到的細(xì)菌污染進(jìn)行防控，取得豐碩果實(shí)。越來(lái)越多噬菌體產(chǎn)品已通過審批，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中，如表1。

表1 噬菌體產(chǎn)品名稱Tab.1 Phage products

1 噬菌體對(duì)家禽及其產(chǎn)品中的應(yīng)用

2014年，El-Gohary[16]等將肉雞暴露于大腸桿菌環(huán)境中，使其間接感染大腸桿菌，然后將噬菌體噴灑到接種大腸桿菌的褥草上，觀察肉雞的狀態(tài)，3周齡時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組肉雞與對(duì)照組(不噴灑噬菌體)相比死亡率降低、體重增加、且未觀察到噬菌體對(duì)肉雞有不良作用。

2004年和2005年，Atterbury等[17]從屠宰場(chǎng)、家禽農(nóng)場(chǎng)及廢水中分離得到 232株沙門菌噬菌體，對(duì)其中宿主譜最寬的3株噬菌體進(jìn)行清除雞體內(nèi)沙門菌定植的研究。相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌分別減少1.53±2.38 log10CFU/g，3.48±1.88 log10CFU/g(P<0.000 1)，在24 h內(nèi)，3株噬菌體均可顯著地降低雞體內(nèi)腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的定植。

Spricigo[18]等使用包含3種烈性噬菌體UAB_Phi20，UAB_Phi78，UAB_Phi87的沙門菌噬菌體混合制劑，用于減少雞胸肉、鮮雞蛋等的沙門菌污染。雞胸肉首先在沙門菌菌液浸泡5 min，隨后在含有100 mL噬菌體混合物的無(wú)菌袋中攪拌5 min，并4 ℃冷藏7 d，結(jié)果后腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌分別降低0.9 log10CFU/g和2.2 log10CFU/g(P≤0.000 1)。同樣的方法處理雞蛋，25 ℃孵育2 h后，腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌降低約0.9 log10CFU/cm2(P≤0.005)。

2 噬菌體在家畜及其產(chǎn)品中的應(yīng)用

龐亮亮[19]等對(duì)豬鏈球菌2型及其烈性噬菌體SMP進(jìn)行定量與定性的研究，通用噬菌體SMP治療豬鏈球菌攻擊后的CD1小鼠，噬菌體不僅對(duì)豬鏈球菌有殺菌作用，同時(shí)會(huì)降低細(xì)菌高峰期的峰值，對(duì)小鼠具有明顯的保護(hù)作用。

Coffey[20]等研究噬菌體e11/2和e4/1c組成混合制劑對(duì)牛皮毛上大腸桿菌 O157∶H7的抑菌效果。研究中分別以噬菌體混合制劑和水為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，噴灑于接種大腸桿菌 O157∶H7的牛皮(20 cm × 20 cm)，1 h后，相比于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組牛皮毛上的大腸桿菌 O157∶H7顯著降低。2007 年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA) 批準(zhǔn)了Omnilytics 公司生產(chǎn)的針對(duì)大腸桿菌O157∶H7、沙門菌的噬菌體產(chǎn)品作為噴霧或清洗劑，用于消減宰前牛體表的病原微生物[15]。這為噬菌體制劑成為商業(yè)化產(chǎn)品應(yīng)用于控制細(xì)菌性疾病邁出了重要的一步。

3 噬菌體在果蔬、器皿中的應(yīng)用

Abuladze[21]等研究使用3種噬菌體(ECML-4，ECML-117，ECML-134)混合制劑ECP-100控制番茄、菠菜、西蘭花中大腸桿菌O157∶H7的污染。研究中使用包含不同滴度的噬菌體混合物(1010、109、108PFU/mL)處理樣品5 min后，番茄、菠菜、西蘭花中大腸桿菌的減少范圍可達(dá)94%～100%，表明噬菌體混合物有助于減少水果、蔬菜中的大腸桿菌O157∶H7污染。在2011年ECP-100，商業(yè)名稱為EcoShieldTM已經(jīng)得到美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準(zhǔn)作為食品添加劑用于控制紅肉中大腸桿菌O157∶H7的污染。

Soni[22]等研究噬菌體 P100 對(duì)生物膜條件下李斯特菌的抑制作用，結(jié)果顯示代表13種不同血清型的21株單核細(xì)胞增生李斯特菌顯著減少。在不銹鋼表面，同樣經(jīng)噬菌體處理后，單核細(xì)胞增生李斯特菌減少3.5-5.4 log10CFU/cm2，研究結(jié)果表明噬菌體P100對(duì)不銹鋼等食品器具表面生物膜下的單核細(xì)胞增生李斯特菌具有一定的抑菌作用。鑒于對(duì)噬菌體P100的安全性評(píng)估及抗菌效果的認(rèn)可，美國(guó)FDA和USDA批準(zhǔn)LISTEX P100可作為一種天然抗菌物質(zhì)應(yīng)用于所有食品生產(chǎn)中對(duì)李斯特菌的控制。

李錦銓[23]等利用噬菌體LPSE1、LPST10及兩者混合物分別評(píng)估其對(duì)牛奶、火腿和生菜污染的腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的削減能力。牛奶和火腿的實(shí)驗(yàn)中，在MOI=1和MOI=100條件下處理6 h后，腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的削減約1-5 log10CFU/mL，而生菜在處理0-5 h后，細(xì)菌數(shù)量隨處理時(shí)間的增加逐漸減少，當(dāng)MOI=100時(shí)，菌量在短時(shí)間內(nèi)可減少0.3-0.6 log10CFU/mL，抑菌效果明顯。

4 噬菌體裂解酶在食品中的應(yīng)用

自20世紀(jì)50年代第一次發(fā)現(xiàn)噬菌體裂解酶到目前為止，陸續(xù)出現(xiàn)關(guān)于噬菌體裂解酶的研究報(bào)道，包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌O157、副溶血性弧菌、沙門菌等[24-25]。Obeso[24]等將裂解酶lysH5成功克隆表達(dá)并表明其對(duì)于牛奶中生長(zhǎng)的金黃色葡萄球菌有明顯的殺菌效果，且不會(huì)影響不同屬的其他細(xì)菌。這是首次評(píng)估噬菌體抗微生物活性的研究，該酶可以作為新型的生物防治策略應(yīng)用于乳制品。

2013年，Micreos推出了全球第一個(gè)基于噬菌體裂解酶的人類健康產(chǎn)品，名為StaphefektTM，它專門針對(duì)金黃色葡萄球菌，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，Micreos同時(shí)開發(fā)了含有Staphefekt的一系列霜和凝膠，同屬于品牌Gladskin。研究顯示每天使用Gladskin可抑制皮膚上的金黃色葡萄球菌，減輕相關(guān)的炎癥癥狀，并且不會(huì)傷害皮膚上的有益微生物。

國(guó)內(nèi)有關(guān)于噬菌體裂解酶的報(bào)道逐漸增多。李萌[25]成功克隆表達(dá)裂解酶LysSTP4，進(jìn)一步研究后，LsySTP4比源噬菌體的裂解譜更寬泛，與膜通透劑 EDTA協(xié)同作用能夠有效抑制沙門菌的生長(zhǎng)。顧敏敬[26]表達(dá)并純化針對(duì)MRSA的噬菌體裂解酶LysGH15，在小鼠體內(nèi)給予50 μg時(shí)，LysGH15 即可有效的保護(hù)菌血癥狀態(tài)的小鼠。

噬菌體裂解酶以較小的量發(fā)揮巨大作用，同時(shí)可以避免噬菌體本身所具有的抗原性。毋庸置疑，噬菌體裂解酶的研究開發(fā)表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。

5 展 望

綜上所述，應(yīng)用噬菌體及其相關(guān)蛋白作為治療手段控制食品中病原菌是可行、無(wú)污染、且極具發(fā)展空間的方法。噬菌體和噬菌體裂解酶具有特異性強(qiáng)、效率高、吸收分布好等特點(diǎn)，使得以噬菌體為基礎(chǔ)的療法成為可能。但依然有許多因素限制其發(fā)展，例如噬菌體存在嚴(yán)格的宿主特異性，是造成其宿主譜狹窄的主要原因，單獨(dú)使用顯然缺乏力度且使用范圍受到限制，其次噬菌體同樣存在突變或失活、噬菌體制劑保存、可能會(huì)促進(jìn)耐藥基因擴(kuò)散等問題。針對(duì)其不足，研究者們提出許多應(yīng)對(duì)策略，拓寬宿主譜、確認(rèn)并完善噬菌體的安全評(píng)估、開發(fā)裂解酶防治細(xì)菌感染的技術(shù)、降低裂解酶研制成本等將成為今后的主要研究方向。這樣以噬菌體治療作為新型的抗菌工具既可充分發(fā)揮其天然優(yōu)勢(shì)，又可通過基因工程等其他方法克服不足，揚(yáng)長(zhǎng)避短，使噬菌體及其相關(guān)酶的應(yīng)用范圍更為廣闊，亦更加靈活。