氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定植物組織中糖與糖醇

項(xiàng) 萍，唐 喆

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

糖醇類物質(zhì)廣泛存在于自然界各種生物中，植物體內(nèi)的糖醇具有提供能量、清除自由基以及調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透壓等生理功能[1]。糖醇類物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的初生代謝物，其含量的變化可直接反映植物組織的生理狀況。枸杞作為西北半干旱地區(qū)常見的植物，不僅是常用的傳統(tǒng)中藥材，還是百姓喜愛的保健品。據(jù)研究報(bào)道，枸杞的果、葉、苗、根都含有多種營養(yǎng)和活性組分，其中以葡萄糖、阿拉伯糖為活性基礎(chǔ)形成的水溶性多糖(LPB)[2]為主。

糖與糖醇類物質(zhì)的檢測方法一般有容量法、分光光度法、酶分析法、色譜分析法等[3-4]，但由于植物組織中糖醇類物質(zhì)的濃度相對較低，使用上述方法很難得到準(zhǔn)確的含量，因此有必要建立一種快速且靈敏的糖醇類物質(zhì)分析方法。氣相色譜法的靈敏度高、分離能力強(qiáng)，能夠有效地分離天然化合物中的同分異構(gòu)體，并能夠?qū)哿课镔|(zhì)進(jìn)行檢測；質(zhì)譜法能夠準(zhǔn)確地確定化合物的分子質(zhì)量，并且推算化合物的分子式，對于鑒定有機(jī)物分子具有重要作用。目前，氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)聯(lián)用技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種檢測中[5-6]，然而，糖醇類物質(zhì)高溫易分解或難以氣化，在進(jìn)行GC/MS分析前要對化合物進(jìn)行衍生化處理。

本研究擬以7種常見的糖醇類物質(zhì)作為目標(biāo)化合物，經(jīng)乙?；幚砗?，以核糖醇作為內(nèi)標(biāo)物，采用GC/MS法測定枸杞葉片和根系中的含糖情況，希望為各種植物組織中糖和糖醇類物質(zhì)的檢測提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GC/MS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜儀：日本島津公司產(chǎn)品，配有Aoc-20i自動(dòng)進(jìn)樣器、Rxi-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；MD200氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；PL303電子天平：梅特勒-托利多上海有限公司產(chǎn)品；THZ-C-1全溫振蕩器：蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

果糖(Flu)、核糖醇(Ado)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、纖維醇(Ino)、甘露醇(Man)、山梨醇(Sor)、蔗糖(Suc)標(biāo)準(zhǔn)品：均為分析純，美國Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、氯仿、1-甲基咪唑、鹽酸羥胺、乙酸酐、無水硫酸鈉：均為分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品。

1.2 乙?；瘶?biāo)準(zhǔn)品的配制

精確稱取各0.005、0.02、0.05、0.1、0.2 mg果糖、葡萄糖、半乳糖、纖維醇、甘露醇、山梨醇、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品，分別加入0.02 mg核糖醇，混勻，再加入少許的1-甲基咪唑懸??；然后加入0.1 mL鹽酸羥胺溶液，混勻后置于80 ℃水浴中振蕩5 min，取出后加入0.15 mL乙酸酐，混勻，于室溫下反應(yīng)5 min；再加入1 mL氯仿萃取衍生化產(chǎn)物，然后用2倍體積水清洗4遍，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后，封裝于色譜瓶中，即得質(zhì)量濃度分別為5、20、50、100、200 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)物核糖醇的濃度為20 mg/L。

1.3 樣品提取以及乙?；幚?/h3>

對枸杞葉片與根系的單雙糖及其可溶性糖醇類化合物進(jìn)行GC/MS測定，具體步驟[1]為：取0.2 g枸杞鮮樣，加入0.02 mg核糖醇作為內(nèi)標(biāo)，液氮環(huán)境中研磨成細(xì)碎粉末，加入4 mL甲醇-氯仿-水(12∶5∶3,V/V/V)碳水化合物抽提液，充分混勻，隨后加入等體積水，混勻，靜置片刻，將上清液過濾至試管中，氮?dú)獯蹈桑淅鋮s后加入少許的1-甲基咪唑懸??；然后加入0.1 mL鹽酸羥胺溶液，混勻后置于80 ℃水浴中振蕩5 min，取出后加入0.15 mL乙酸酐，混勻后于室溫下反應(yīng)5 min，加入1 mL氯仿萃取衍生化產(chǎn)物，用2倍體積水清洗4遍，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后，直接封裝于色譜瓶中，待測。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 載氣He，流速0.8 mL/min；清洗流速3 mL/min，線速度32.4 cm/s；升溫程序：柱溫50 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升至200 ℃，以10 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 轟擊電壓70 eV，界面溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，檢測器電壓0.9 kV，溶劑切割時(shí)間3 min，質(zhì)量掃描范圍m/z35～900。

2 結(jié)果與分析

2.1 8種乙酰糖的Scan模式定性分析

注：1.果糖；2.核糖醇(內(nèi)標(biāo)物)；3.葡萄糖；4.半乳糖；5.纖維醇；6.甘露醇；7.山梨醇；8.蔗糖圖1 8種乙酰化的糖和糖醇的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 8 acetylated sugars and sugar alcohols

將乙酰化后的標(biāo)準(zhǔn)品通過單標(biāo)進(jìn)樣確定每種物質(zhì)的保留時(shí)間，進(jìn)混標(biāo)樣后優(yōu)化升溫程序、調(diào)整測試參數(shù)，從而達(dá)到較好的分離效果，得到的總離子流圖示于圖1。

2.2 SIM模式定量分析

SIM模式較Scan模式的靈敏度有很大提高[7]。本研究根據(jù)8種乙?；瘶?biāo)準(zhǔn)品Scan模式的質(zhì)譜圖，選定特征離子創(chuàng)建了SIM方法，并對混合標(biāo)樣進(jìn)行分析，得到的離子流圖示于圖2，乙?；奶呛吞谴嫉腟IM模式參考離子列于表1。由于糖和糖醇類物質(zhì)含有較多的羥基，乙酰化處理后形成的酰氧鍵極易斷裂形成m/z43碎片離子，且豐度較高，結(jié)合其他特征碎片和保留時(shí)間，可以高選擇、高靈敏地檢測糖和糖醇類物質(zhì)的含量。

圖2 8種乙酰化的糖和糖醇的SIM模式總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of 8 acetylated sugars and sugar alcohols at SIM mode

峰號Peaknumber糖和糖醇Sugarsandsugaralcohols保留時(shí)間tR/min參考離子Referenceions(m/z)1果糖12 3543，103，1452核糖醇13 6343，115，1453葡萄糖14 5643，145，1034半乳糖14 7943，145，1035纖維醇15 7443，168，1266甘露醇15 8743，115，1397山梨醇15 9643，115，1458蔗糖28 5843，169，211

2.3 SIM方法的檢出限、回收率和精密度

分別取1.2節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液，采用1.3節(jié)方法對標(biāo)準(zhǔn)溶液乙?；幚砗?，按1.4節(jié)條件上機(jī)測定。為了避免前處理過程導(dǎo)致的誤差，選取植物組織中含量極少的核糖醇作為內(nèi)標(biāo)物，以其他標(biāo)準(zhǔn)品與核糖醇峰面積比y對7種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量濃度與核糖醇比x做線性回歸，以信噪比3計(jì)算檢出限，信噪比10計(jì)算定量限，其結(jié)果列于表2?？梢姡堑臋z出限為5.5 mg/L外，其他糖和糖醇的檢出限均低于0.11 mg/L。

選取一組枸杞根樣品，在前處理前添加一定量的可溶性糖進(jìn)行分析檢測，重復(fù)測定5次，考察該方法在實(shí)際樣品中的回收率與精密度，結(jié)果列于表3。結(jié)果表明，回收率在96.98%～103.62%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～4.9%，該方法精密度良好，能夠滿足定量分析的要求。

表2 乙?；奶呛吞谴嫉墓ぷ髑€、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients,limits of detection and limits of quantification of 8 acetylated sugars and sugar alcohols

表3 SIM模式下方法的回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions at SIM mode

2.4 方法的應(yīng)用

選取枸杞葉片與根系作為樣本進(jìn)行糖和糖醇的測定，結(jié)果列于表4?？梢?，枸杞根中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量約是葉片中的2倍，這是因?yàn)楦饕獏⑴c植物無機(jī)離子和水的吸收，需要大量的能量，這些糖類可為根提供更多的能量。半乳糖和纖維醇是植物細(xì)胞重要合成物的前體，其中，半乳糖是植物果膠類成分的重要組成，纖維醇可用于植物細(xì)胞壁的合成[8-9]，二者對枸杞的根和葉細(xì)胞具有同等重要的作用，二者的含量差異不大。山梨醇和甘露醇是單糖的重要衍生物，主要用于調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，提高植物抗逆性[10-11]，由于根處于復(fù)雜環(huán)境中，需要對滲透壓有良好的調(diào)節(jié)能力，所以山梨醇和甘露醇的含量較高。

實(shí)際的枸杞樣品測定結(jié)果和理論分析表明，本實(shí)驗(yàn)采用的GC/MS選擇離子監(jiān)測(SIM)模式可以準(zhǔn)確地測定植物組織中的糖醇含量。雖然樣品的乙?；幚碓黾恿饲疤幚聿襟E，但是操作簡單，試劑為常規(guī)試劑，成本較低。同時(shí)，采用核糖醇作為內(nèi)標(biāo)物，有效地減小了誤差。該方法可以去除背景干擾，得到清晰準(zhǔn)確的色譜峰，比GC/MS法全掃描模式的靈敏度高，適合測定糖含量較低的植物組織。

表4 枸杞葉片與根系中的糖和糖醇含量(mg/g)Table 4 Contents of sugars and sugar alcohols in leaves and roots of Lycium chinensis (mg/g)

3 結(jié)論

本研究采用GC/MS法SIM模式快速分析測定乙酰糖和乙酰糖醇，以枸杞的根和葉片為例進(jìn)行了準(zhǔn)確的定量分析。為了避免乙?；^程影響測定結(jié)果，選擇核糖醇作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析，同時(shí)SIM模式降低了基質(zhì)干擾、提高了靈敏度。該方法可為糖和糖醇類物質(zhì)的檢測提供參考依據(jù)。

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