巴戟天中環(huán)烯醚萜苷和蒽醌在電噴霧離子源負(fù)離子模式下的質(zhì)譜裂解行為

趙祥升，楊美華，吳海峰，舒曉燕

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，海南 ?？?571100；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；3.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010)

巴戟天為茜草科多年生植物巴戟天(MorindaofficinalisHow)的干燥根，是我國(guó)著名的南藥和保健藥材，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕之功效，在臨床上主要用于治療陽(yáng)痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、少腹冷痛、風(fēng)濕痹痛、筋骨萎軟等癥[1]。巴戟天主要分布于廣東、海南、廣西、福建等熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]，主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類、蒽醌類和多糖[3-4]。目前，從巴戟天中已分離得到7種環(huán)烯醚萜苷和34種蒽醌類化合物[5]，并對(duì)這些化合物進(jìn)行了定性和定量分析[6-8]，但尚未見(jiàn)巴戟天中主要環(huán)烯醚萜苷類和蒽醌類化合物裂解行為的報(bào)道。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是快速分離和鑒定天然藥物中活性成分的有效方法，電噴霧-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF MS)等高分辨質(zhì)譜技術(shù)憑借其在質(zhì)量精度、全質(zhì)量數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)可溯源性等方面的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于中藥分析領(lǐng)域[9-10]。利用LC-Q-TOF MS 既可以獲得化合物的分子離子信息，又可以在碰撞碎裂后獲得豐富的離子碎片信息，有助于準(zhǔn)確推測(cè)其可能的分子式以及化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律[11]。環(huán)烯醚萜苷類和蒽醌類化合物在電噴霧負(fù)離子模式下有較高的靈敏度，能夠獲得豐富的碎片離子信息[12-13]。

本工作擬在UPLC-ESI-Q/TOF MS負(fù)離子模式下，對(duì)巴戟天中主要的4種環(huán)烯醚萜苷(水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、車葉草苷酸和車葉草苷)和2種蒽醌類(甲基異茜草素和甲基異茜草素-1-甲醚)化合物的質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行研究，以期為其他同類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定提供技術(shù)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Waters AcquityTMUPLC 色譜儀，Waters Xevo G2-XS四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Mili-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；DK-S型電熱恒溫水浴鍋：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；XS105DU電子分析天平：上海托利多有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

巴戟天：采自海南，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所南藥資源中心鑒定為茜草科植物巴戟天(MorindaofficinalisHow)的根；甲醇、乙腈、甲酸：均為色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：Mili-Q超純水；水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、車葉草苷酸和車葉草苷對(duì)照品：純度>98%，上海同田生物科技有限公司產(chǎn)品；甲基異茜草素和甲基異茜草素-1-甲醚對(duì)照品：純度>98%，成都克洛瑪生物科技有限公司產(chǎn)品。6種對(duì)照品的結(jié)構(gòu)式示于圖1。

圖1 6種對(duì)照品的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of 6 compounds

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子掃描模式；毛細(xì)管電壓2.5 kV；錐孔電壓50 V；離子源溫度125 ℃；校正液為亮氨酸腦啡肽；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200；脫溶劑氣(N2)流速800 L/h；脫溶劑氣溫度600 ℃；碰撞氣為氬氣；注射泵直接進(jìn)樣。

1.4 供試溶液的制備

精密稱取適量的水晶蘭苷、去乙酰車葉草苷酸、車葉草苷酸、車葉草苷、甲基異茜草素和甲基異茜草素-1-甲醚對(duì)照品，用甲醇溶解，并定容至25 mL容量瓶中，搖勻，使對(duì)照品濃度為1 mg/L，過(guò)0.22 μm濾膜，即得供試溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析

電噴霧電離是一種軟電離技術(shù)，易得到相對(duì)分子質(zhì)量信息，但利用該技術(shù)產(chǎn)生的準(zhǔn)分子離子內(nèi)能較小，產(chǎn)生的碎片離子較少[14]。在ESI-模式下的一級(jí)質(zhì)譜中，6種對(duì)照品化合物均檢測(cè)到脫氫準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-，幾乎沒(méi)有碎片離子，易于確定化合物的相對(duì)分子質(zhì)量。在得到準(zhǔn)分子離子后，調(diào)整碰撞誘導(dǎo)解離能，可獲得豐富的結(jié)構(gòu)信息，6種化合物[M-H]-離子的ESI-MS/MS譜圖示于圖2。

2.2 二級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律分析

2.2.1環(huán)烯醚萜苷 環(huán)烯醚萜類化合物的基本母核是環(huán)烯醚萜醇，具有環(huán)狀烯醚及半縮醛羥基，半縮醛羥基性質(zhì)活潑，故該類化合物多以苷類存在[15]。巴戟天中的環(huán)烯醚萜苷屬于環(huán)戊烯型，由1個(gè)特征的二氫吡喃環(huán)順式連接1個(gè)五元環(huán)。通常，該類化合物首先丟失中性分子H2O、CO2、葡萄糖殘基等，其次是二氫吡喃環(huán)和糖環(huán)(葡萄糖)的斷裂[12]。以車葉草苷酸為例，二氫吡喃環(huán)和糖環(huán)的斷裂途徑示于圖3，其母環(huán)斷裂后形成的特征離子可用于鑒別母核結(jié)構(gòu)[12,15]。

注：a.水晶蘭苷；b.去乙酰車葉草苷酸；c.車葉草苷酸；d.車葉草苷；e.甲基異茜草素；f.甲基異茜草素-1-甲醚圖2 6種化合物[M-H]-離子的ESI-MS/MS圖譜Fig.2 ESI-MS/MS spectra of [M-H]- ions of 6 compounds

圖3 環(huán)烯醚萜苷類化合物的裂解途徑Fig.3 Fragmentation pathway of iridoid glycosides

調(diào)節(jié)碰撞電壓，對(duì)車葉草苷酸的準(zhǔn)分子離子[M-H]-m/z431進(jìn)行CID分析，產(chǎn)生了m/z371、269、251、225、191、165、147、179、119等碎片離子(圖2c)，其中m/z371比m/z431減少了60 u，推測(cè)可能是C8位上中性丟失了1分子CH3COOH，而相似的丟失也發(fā)生在m/z191與m/z251之間。在環(huán)烯醚萜苷的MS/MS中，中性丟失葡萄糖殘基(162 u，Glc)和葡萄糖(180 u，Glucose)比較常見(jiàn)，離子m/z269 (m/z431-162 u)和m/z251(m/z431-180 u)均是由此產(chǎn)生的。碎片離子m/z225、251是由前體離子m/z269脫去C4(6)上的CO2和H2O 分子形成；m/z251 進(jìn)一步失去1分子CO2得到碎片離子m/z207。此外，還發(fā)現(xiàn)了脫去乙烯酮(C2H2O)的現(xiàn)象，如m/z183(m/z225 -C2H2O)、m/z165(m/z207-C2H2O)的形成。由上述分析可知，車葉草苷酸主要的裂解途徑是丟失Glc、CO2、H2O、CH3COOH、C2H2O等母環(huán)上的功能基團(tuán)。

圖4 ESI負(fù)離子模式下，車葉草苷酸可能的裂解途徑 Fig.4 Proposed fragmentation pathways of asperulosidic acid in ESI-MS/MS

車葉草苷的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜裂解途徑與車葉草苷酸類似，但其裂解途徑較車葉草苷酸簡(jiǎn)單，在MS/MS中形成的碎片離子較少，主要有m/z147、191等(圖2c)，這些離子主要是由母環(huán)脫去取代基生成的。但增加解離電壓后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)二氫吡喃環(huán)斷裂的特征離子，只發(fā)現(xiàn)了糖環(huán)斷裂特征離子m/z119。ESI負(fù)離子模式下車葉草苷的裂解行為示于圖5。

圖5 ESI負(fù)離子模式下，車葉草苷可能的裂解途徑 Fig.5 Proposed fragmentation pathways of asperuloside in ESI-MS/MS

去乙酰車葉草苷酸的結(jié)構(gòu)與車葉草苷酸類似，僅脫去1分子乙烯酮。在MS/MS中，去乙酰車葉草苷酸主要脫去母核的取代基，如H2O、CO2、葡萄糖殘基或葡萄糖。碎片離子m/z371、345、227、209是由準(zhǔn)分子離子m/z389[M-H]-分別脫去1分子H2O、CO2、葡萄糖殘基和葡萄糖形成；離子m/z371、209、191失去1分子CO2，形成碎片離子m/z327、165、147；離子m/z327、191、165、147也有可能由其前體離子(m/z345、209、183、165)失去1分子H2O形成。去乙酰車葉草苷酸中母環(huán)和糖環(huán)也發(fā)生了斷裂，形成了m/z119、113、101、89、71、59等離子，但母環(huán)較糖環(huán)斷裂后形成的碎片離子豐度低。去乙酰車葉草苷酸可能的裂解途徑示于圖6。

水晶蘭苷為去乙酰車葉草苷酸的同分異構(gòu)體，二者的質(zhì)譜裂解行為類似，主要是母核上取代基的丟失和糖環(huán)的斷裂，但碎片離子豐度不同。水晶蘭苷在ESI負(fù)離子模式下可能的裂解途徑示于圖7，其裂解行為在越桔屬植物中已有報(bào)道[19]。

2.2.2蒽醌 蒽醌類化合物中，酚羥基上O原子和苯環(huán)間存在p-π共軛，共軛體系結(jié)構(gòu)決定了其分子的穩(wěn)定性。在質(zhì)譜選擇性離子碰撞誘導(dǎo)解離中，該類化合物的主要裂解方式是逐級(jí)失去母核基團(tuán)中CO并保留共軛體系。此外，側(cè)鏈取代基(主要為OH、CH3、OCH3、COOH)容易以H2O、CH3、CH2、 CO2等中性小分子片段的形式丟失[20-21]。

甲基異茜草素與甲基異茜草素-1-甲醚的結(jié)構(gòu)相似，僅C1位的取代基(OH、OCH3)不同，在ESI負(fù)離子模式下均能生成信號(hào)較強(qiáng)的[M-H]-準(zhǔn)分子離子(m/z253和m/z267)，二者可能的裂解途徑示于圖8。在MS/MS下，離子m/z225和m/z209 由分子離子峰[M-H]-m/z253 分別丟失1分子CO和CO2所得；m/z225繼續(xù)失去1分子CO得到m/z197 碎片離子；離子m/z209分別失去1分子CO和CH2得到碎片離子m/z181 和m/z195。甲基異茜草素-1-甲醚準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-m/z267 的裂解比甲基異茜草素簡(jiǎn)單，主要產(chǎn)生了m/z252 [M-H-CH3]-和m/z224 [M-H-CH3-CO]-2個(gè)碎片離子。

圖6 ESI負(fù)離子模式下，去乙酰車葉草苷酸可能的裂解途徑Fig.6 Proposed fragmentation pathways of deacetyla sperulosidic acid in ESI-MS/MS

圖7 ESI負(fù)離子模式下，水晶蘭苷可能的裂解途徑Fig.7 Proposed fragmentation pathways of monotropein in ESI-MS/MS

圖8 ESI負(fù)離子模式下，甲基異茜草素可能的裂解途徑Fig.8 Proposed fragmentation pathways of rubiadin in ESI-MS/MS

3 結(jié)論

使用ESI-Q-TOF MS/MS技術(shù)研究了巴戟天中4種環(huán)烯醚萜苷和2種蒽醌類化合物的裂解行為，分析了化合物在負(fù)離子模式下主要的特征碎片離子、裂解模式和相應(yīng)的質(zhì)譜圖。環(huán)烯醚萜苷在ESI-模式下主要的裂解途徑首先是脫去母環(huán)上的功能取代基，如H2O、CO2、CH3COOH和糖單元等；其次是母環(huán)上半縮醛結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化造成二氫吡喃環(huán)和糖環(huán)的斷裂。而蒽醌類化合物，逐級(jí)丟失CO和取代基是該類成分主要的裂解途徑。

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