可生物素化HLADRB1*07：01蛋白的原核表達(dá)和純化

李敏英 李文 陶愛林

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東省過敏反應(yīng)與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510260）

抗原提呈細(xì)胞（antigen?presenting cell，APC）攝取抗原并將其處理成免疫原性多肽，以抗原肽?MHC分子復(fù)合物的形式表達(dá)于APC表面，供T細(xì)胞表面（T cell receptor，TCR）識(shí)別［1］，CD4+T細(xì)胞通過識(shí)別MHCⅡ?肽復(fù)合物而被激活，調(diào)節(jié)或者協(xié)助細(xì)胞免疫及體液免疫，在免疫應(yīng)答中起非常重要的作用，檢測(cè)抗原特異性CD4+T細(xì)胞的傳統(tǒng)手段有酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法（ELISPOT）和有限稀釋法（LDA）等，但靈敏度較低。1996年，ALTMAN等［2］建立MHC?肽四聚體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，利用MHC?肽四聚體成功地通過流式細(xì)胞儀在單個(gè)細(xì)胞水平上檢測(cè)特異性T細(xì)胞，為定量檢測(cè)特異性T細(xì)胞提供了新的有效手段。

據(jù)報(bào)道［3-5］，HLA?DRB1*07：01與天冬酰胺酶的超敏反應(yīng)相關(guān)，攜帶HLA?DRB1*07：01基因型的人群有較高的風(fēng)險(xiǎn)對(duì)天冬酰胺酶過敏。對(duì)此，我們可以利用MHCⅡ?四聚體這一技術(shù)來體外確定HLA-DRB1*07：01與對(duì)天冬酰胺酶高親和力的表位肽，制備重組的表位肽疫苗，或通過突變把高親和力表位肽改造成低親和力肽，降低患者對(duì)天冬酰胺酶的免疫應(yīng)答，也用于特異性免疫治療。此外，在對(duì)HLA?Ⅱ的研究中發(fā)現(xiàn)，HLA?DRB1*07：01這一基因型與許多疾病有關(guān)，比如白癜風(fēng)［6-8］、拉帕替尼（用于晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療）誘導(dǎo)的肝損傷［9-11］、銀屑?。?2-14］等疾病相關(guān)，以及據(jù)本實(shí)驗(yàn)室的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，多種過敏原與HLA?DRB1*07：01的親和力均較強(qiáng)，與對(duì)應(yīng)的過敏性疾病相關(guān)度高。因此，HLA?DRB1*07：01的表達(dá)純化和其MHC?Ⅱ四聚體的制備，對(duì)這些相關(guān)疾病的研究具有重要的意義和價(jià)值。

為使MHCⅡ的α亞基和β亞基可在體外二聚化，形成結(jié)構(gòu)完整的MHCⅡ蛋白。本文在2個(gè)亞基跨膜區(qū)加入亮氨酸拉鏈，亮氨酸拉鏈?zhǔn)怯缮煺沟陌被峤M成，每7個(gè)氨基酸殘基中的第7個(gè)氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在螺旋的一側(cè)，所有帶電荷的氨基酸殘基排在另一側(cè)。當(dāng)2個(gè)蛋白質(zhì)分子平行排列時(shí)，亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形成“拉鏈”。為了獲得生物素化的MHCⅡ，在β鏈跨膜區(qū)加入Avi標(biāo)簽，其由15個(gè)氨基酸殘基（GLNDIFEAQKIEWHE）組成，具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化序列完全不同，融合表達(dá)后，可被生物素連接酶（如BirA）生物素化，可用于蛋白質(zhì)分離純化和蛋白質(zhì)相互作用研究。無論在體外或者體內(nèi)，幾乎所有的蛋白都可以在一個(gè)獨(dú)特的Avi Tag位點(diǎn)輕易且有效地被生物素化。

1 材料與方法

1.1 材料DNA marker、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa公司，表達(dá)載體pET44a為實(shí)驗(yàn)室保存，pETduet?1購自長沙愛科博生物科技有限公司，蛋白marker購自Thermo公司，T4連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司，Agarose購自上海海生公司，PVDF膜購自Millipore公司，兔抗HLA?DRA抗體購自Sigma公司（貨號(hào)：HPA050162?100 UL），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體購自CST公司（貨號(hào)：7074S），辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素抗體購自Abcam公司（貨號(hào)：ab7403），測(cè)序公司為廣州擎科生物技術(shù)有限公司，封閉液：5%脫脂奶粉，PBS溶解，包涵體洗液含100 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Triton X?100，pH 8.0。

1.2 HLA質(zhì)粒的構(gòu)建從Genbank中獲得HLA?DRB1*07：01的cDNA序列，人工合成基因片段時(shí)，α鏈、β鏈的跨膜區(qū)加入亮氨酸拉鏈，其中β鏈還在跨膜區(qū)加入Avi標(biāo)簽。利用NdeⅠ和XhoⅠ將含目的基因HLA α鏈、β鏈的質(zhì)粒和表達(dá)載體pET44a、pETduet?1?BirA雙酶切，PCR鑒定后，使用T4 DNA連接酶將HLA α鏈、β鏈分別構(gòu)建于表達(dá)載體pET44a和pETduet?1?BirA上，然后轉(zhuǎn)至JM109中，于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基涂平板，37℃過夜后，挑取單菌落做菌落PCR鑒定，α鏈的上游引物P1：5′?CATATGATCAAAGAAGAACATGTG?3′，下游引物P2：5′?CTCGAGTTATTAAGCAGCCAGGATG?3′，β鏈的上游引物 P3：5′?CATATGGGGGACACCCA?ACC?3′，下游引物 P4：5′?CTCGAGTTATTAATTGT?GCC?3′，BirA 的上游引物P5：5′?CGCGGATGAAG?GATAACACCGTG?3′，下游引物P6：5′?ACGCGTCG?ACTTATTTTTCTGCACTACG?3′，然后將陽性菌落接種于LB含Amp的液體培養(yǎng)基中，37℃搖（200 r/min）過夜后用于提取質(zhì)粒和公司測(cè)序。

1.3 HLA的誘導(dǎo)表達(dá)將上述含有正確目的基因的 pET44a?HLA α鏈和 pETduet?1?HLA β鏈?BirA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株Rosetta中后，接種于含Amp的LB瓊脂平板中，37℃過夜后挑選陽性克隆后，在接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，按1∶50的量加入20%的葡萄糖，37℃搖菌至菌液OD600nm值約為0.6～0.8時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，其中HLA β鏈的誘導(dǎo)需加入0.5 mmol/L生物素，37℃，200 r/min搖菌，誘導(dǎo)4 h后，各個(gè)收集1 mL菌液，10 000g，2 min離心后，去掉上清，制樣后沸水煮10 min，離心后SDS?PAGE電泳，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。

1.4 Western印跡鑒定HLA蛋白將上述樣品制樣電泳后，將凝膠上的條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后都加入封閉液室溫孵育1 h，封閉后HLA α鏈加入的一抗為兔抗HLA?DRA，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，HLA β鏈只需孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素抗體。

1.5 HLA蛋白的可溶性分析及純化將誘導(dǎo)后的菌體收集后，以 100 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA重懸，在冰浴中超聲裂解菌體。離心后分別收集上清和沉淀，利用SDS?PAGE電泳分析目的蛋白的可溶性后，用洗液洗滌包涵體3次，每次4℃攪拌30 min，在用不含TritonX?100的洗液洗1遍，最后再用6 mol/L尿素（含100 mmol/L Tris?HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA）變性溶解，通過SDS?PAGE分析各管組分。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建將含有目的基因的質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切和PCR鑒定大小正確（圖1、2）后，切膠回收，將HLA α鏈的基因片段連接到pET44a載體上，β 鏈的基因片段連到 pETduet?1?BirA上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，涂板過夜后挑取單菌落做PCR鑒定，α鏈PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在約750 bp，BirA的顯示約100 bp，β鏈的顯示在約750 bp處有特異性條帶擴(kuò)增，大小均與目的基因相符，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖3、4）。

圖 1 pUC57?HLA?DRB10701 α鏈雙酶切Fig.1 Identification of pUC57?HLA?DRB10701 α chain by digestion

圖2 pET44a?1?HLA?DRB10701 β鏈雙酶切Fig.2 Identification of pET44a?1?HLA?DRB10701 β chain by digestion

圖3 pET?44a?HLA?DRB10701 α鏈的PCR鑒定Fig.3 Identification of pET?44a?HLA?DRB10701 α chain by PCR

圖4 pETduet?1?HLA?DRB10701 β 鏈?BirA的PCR 鑒定Fig.4 Identification of pETduet?1?HLA?DRB10701 β chain?BirA by PCR

2.2 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)將含有目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Rosetta中，均加入終濃度為0.25 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，取部分菌液制樣進(jìn)行SDS?PAGE凝膠電泳，結(jié)果顯示加入IPTG后成功誘導(dǎo)表達(dá)分子量分別為34和29 kD，其分子量與目標(biāo)蛋白的大小相符（圖5A、6A）。

2.3 Western印跡鑒定目的蛋白將誘導(dǎo)后的菌液制樣，經(jīng)SDS?PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，α鏈用兔抗HLA?DRA抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗，ECL顯色。生物素化的β鏈用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素孵育，ECL顯色。結(jié)果顯示HLA?DRA和鏈霉素均可分別與目的蛋白結(jié)合，而未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液作為陰性對(duì)照，未見有結(jié)合條帶（圖5B、6B）。

2.4 目的蛋白的可溶性分析及純化菌體收集后，冰上超聲裂解，離心后分別取上清和沉淀制樣，利用SDS?PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白不溶（圖7），主要為包涵體表達(dá)，收集包涵體后洗滌3次，最后用6 mol/L尿素溶解得到變性蛋白。通過SDS?PAGE電泳分析蛋白純化效果，可見純化后蛋白純度較高（圖8）。

圖5 HLA?DRB10701 α鏈的誘導(dǎo)表達(dá)與Western blot分析Fig.5 Expression of HLA?DRB10701 α chain and Western blot analysis

圖6 可生物素化HLA?DRB10701 β鏈的誘導(dǎo)表達(dá)與Western blot分析Fig.6 Expression of Biotinylated HLA?DRB10701 β?chain and Western blot Analysis

圖7 重組HLA?DRB10701的可溶性分析Fig.7 Soluble analysis of recombinant HLA?DRB10701

圖8 純化前后HLA?DRB10701的SDS?PAGE電泳分析Fig.8 Analysis of HLA?DRB10701 by SDS?PAGE before and after purification

3 討論

MHCⅡ是由α鏈和β鏈組成的異源二聚體，2條鏈分別由HLAⅡ類α和β基因編碼，均具有多態(tài)性。2條多肽鏈的基本結(jié)構(gòu)相似，氨基端在胞外，羧基端在胞內(nèi)，胞外部分占整條鏈的2/3。α鏈和β鏈胞外部分可再分為2個(gè)結(jié)構(gòu)域，稱為α1、α2和β1、β2，其中α1和β1構(gòu)成肽結(jié)合槽，錨合抗原呈遞細(xì)胞（APC）中外源性抗原短肽，形成MHCⅡ類分子-肽復(fù)合物，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，與特異性CD4+T細(xì)胞表面的TCR結(jié)合，激活并使之發(fā)揮作用。

在早期許多學(xué)者對(duì)MHC分子體外結(jié)合多肽的研究沒有取得較好的效果，其原因之一是單個(gè)MHC?肽復(fù)合物（pMHC）與TCR的結(jié)合親和力低、解離速度快。而ALTMAN等［2］在研究中發(fā)現(xiàn)四分子的pMHC與TCR具有較強(qiáng)的親和力。MHCⅡ?肽四聚體是在Ⅱ類分子β鏈跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)位置被末端帶有BirA酶底物肽（Avi）的亮氨酸拉鏈（leucine zipper motif）替代，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)加入生物素，利用BirA酶使其體內(nèi)生物素化，再與α鏈、抗原肽折疊，形成可溶性MHC?肽單體分子，加入適當(dāng)比例的鏈霉親和素，即可獲得穩(wěn)定的四聚體［15］。與現(xiàn)有的研究［16］在體外生物素化相比，本文在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物素化，具有更方便快捷，并減少不必要的實(shí)驗(yàn)步驟就可實(shí)現(xiàn)生物素化的好處。

本實(shí)驗(yàn)選用 pET?44a和 pETduet?1 表達(dá)載體，分別構(gòu)建表達(dá)載體 pET?44a?HLA?DRB1*07：01 α鏈和 pETduet?1?HLA?DRB1*07：01 β 鏈?BirA 轉(zhuǎn)化至Rosetta中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS?PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于包涵體中，可以抵抗宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)酶的攻擊，免于大量降解。通過反復(fù)洗滌包涵體，去除大量可溶性雜蛋白，獲得高純度目的蛋白。此外，可參照AYYOUB等［17］設(shè)計(jì)含有一個(gè)His標(biāo)簽的抗原肽，與MHCⅡ分子孵育后，利用親和層析獲得抗原肽與MHCⅡ分子形成穩(wěn)定的pMHC單體?？缮锘亟M表達(dá)蛋白HLA?DRB1*07：01的表達(dá)與純化，為進(jìn)一步制備HLA?肽四聚體奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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