穗花杉雙黃酮通過阻斷絲裂原活化蛋白激酶通路抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解及破骨細(xì)胞的生成

張振 禚小琪 孫鈺 李小磊 張武 顏連啟

1大連醫(yī)科大學(xué)（遼寧大連 116044）；2蘇北人民醫(yī)院骨科，揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（江蘇揚(yáng)州225000）；3北京大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院（北京 100191）

關(guān)節(jié)置換術(shù)已成為治療晚期骨性關(guān)節(jié)炎、老年性股骨頸骨折等疾病的不二選擇，但術(shù)后并發(fā)癥卻一直制約著它的發(fā)展［1］。無菌性假體松動(dòng)是導(dǎo)致翻修手術(shù)的主要并發(fā)癥之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，翻修手術(shù)病例數(shù)已達(dá)同期全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的20%左右［2］。目前認(rèn)為假體周圍產(chǎn)生磨屑，如聚乙烯顆粒和鈦顆粒，招募免疫細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等附著假體周圍［3］，釋放TNF?α 及 IL?1β等促炎性因子，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞、成骨細(xì)胞高表達(dá)RANKL［4］。 當(dāng) RANKL 與 RANK 結(jié) 合 時(shí) ，激 活MAPK等信號通路促使破骨細(xì)胞生成，研究發(fā)現(xiàn)MAPK通路在破骨細(xì)胞的生成及骨吸收中起關(guān)鍵作用［5］。

然而不論是通過改進(jìn)假體還是采用藥物如二磷酸鹽、激素替代等治療，但由于種種不足，至今仍未能找出一個(gè)相對完美的解決措施。

穗花杉雙黃酮（AMF）主要是來源于卷柏的多酚類化合物，具有促骨生成、抗炎等藥效［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)AMF能促進(jìn)干細(xì)胞成骨及骨礦化［6］，因此猜測AMF可能能夠抑制磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解，研究發(fā)現(xiàn)AMF通過阻斷MAPK通路起到抗炎作用［7］，MAPK是破骨細(xì)胞的生成及成熟的關(guān)鍵信號通路之一［5，8］。然而關(guān)于AMF對破骨細(xì)胞的作用未及報(bào)道，因此通過本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AMF是否對破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨溶解起作用，為將來進(jìn)步研究提供部分依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物、試劑健康4周齡雄性C57BL/J6小鼠24只、BABLC小鼠2只（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；AMF（CAS：1617?53?4）；胎牛血清（Gaithers?burg，USA），0.1 U/L盤尼西林，50 μg/mL鏈霉素（Gibco，USA），細(xì)胞計(jì)數(shù) Kit?8（碧云天，中國），RANKL和M?CSF（Peprotech，USA）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立24只C57BL/J6小鼠隨機(jī)分為4組：對照組、鈦顆粒組、低、高濃度組各6只；根據(jù)前文［9］，小鼠依次切開小鼠頭皮，顱骨骨膜，除空白對照組外，其余小鼠顱骨骨膜下包埋去除內(nèi)毒素的鈦顆粒 30 mg［10］，依層縫合，第 2 天起對照組，鈦顆粒組，低、高濃度組分別腹腔注射阿拉伯樹膠（GUM），GUM，AMF?GUM溶液［20、40 mg/（kg·d）］，連續(xù)注射，2周后取出顱骨，行Micro?CT掃描。

1.2.2 Micro?CT掃描矢狀縫與冠狀縫交界區(qū)域進(jìn)行放大，分析骨組織與軟組織的體積比。

1.2.3 組織學(xué)分析掃描后，流動(dòng)的雙蒸水沖洗2 h，10%EDTA脫鈣，3周后取出顱骨，包埋，切片，HE和TRAP染色。

1.2.4 BMMs分離與培養(yǎng)分離BABLC小鼠脛骨及股骨，剪斷骨兩端，沖洗骨髓細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，收集細(xì)胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，懸浮細(xì)胞即BMMs。

1.2.5 CCK?8實(shí)驗(yàn)BMMs以1×104cells/well接種于96孔板，完全培養(yǎng)基（含有30 ng/mL M?CSF，60 ng/mL RANKL的α?MEM培養(yǎng)基）培養(yǎng)，24 h后不同濃度的 AMF（0、2.5、5.0、10、20、40、80、160 μmol/L）干預(yù)，72 h后加入CCK?8試劑，4 h后測量吸光度值。

1.2.6 TRAP染色BMMs以6×103cells/well接種于含完全培養(yǎng)基的96孔板，加入AMF（0、2.5、5.0、10 μmol/L），每2天換液，直至出現(xiàn)融合的多核破骨細(xì)胞，行TRAP染色（全程避光，保持恒溫，避光染色約30 min）。

1.2.7 骨片吸收實(shí)驗(yàn)BMMs細(xì)胞以2.5×104cells/cm2接種于牛骨爬片上，48 h后更換完全培養(yǎng)基，每2天換液至第7天。超聲去除骨片表面的破骨細(xì)胞，掃描電子顯微鏡進(jìn)行掃描。

1.2.8 Western blotting實(shí)驗(yàn)BMMs以4×105cells/well接種于6孔板，AMF（0和10 μmol/L）預(yù)處理4 h，加入RANKL（60 ng/mL）分別刺激0、5、15、30 min和1、3、5 d，收集細(xì)胞；提取蛋白。Bradford檢測蛋白濃度，恒流電泳，恒壓轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂牛奶封閉2 h，一抗4℃隔夜孵育，二抗孵育2 h，ECL（GE，UK）檢測蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法SPSS軟件（版本16.0）分析，結(jié)果從平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)獲得。

2 結(jié)果

2.1 AMF抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解Micro?CT示：骨溶解經(jīng)腹腔注射AMF而被抑制。鈦顆粒組（Vehicle）與對照組（Sham）比較顱骨矢狀縫，冠狀縫間距明顯增寬，可見大量的骨陷窩。而用藥組骨表面可見骨愈合現(xiàn)象，BV/TV比值隨著AMF用藥濃度的增加逐漸增加（圖1）。

2.2 AMF抑制體內(nèi)破骨細(xì)胞的產(chǎn)生組織學(xué)分析示：HE染色，對照組小鼠顱骨光滑，顱骨矢狀縫合緊密，而鈦顆粒組顱骨表面看到顯著的骨破壞，AMF組顱骨表面骨破壞得到了抑制。TRAP染色，鈦顆粒組見到大量的破骨細(xì)胞，隨著AMF濃度的增加，破骨細(xì)胞減少明顯，高濃度組只見到少量的破骨細(xì)胞（圖2）。

圖1 AMF抑制鈦顆粒誘導(dǎo)的顱骨骨溶解Fig.1 Amentoflavone can suppress titanium particles induced?osteolysis of mouse calvaria

注：Vehicle組，明顯的鈦顆粒誘導(dǎo)的顱骨骨溶解現(xiàn)象，HE結(jié)合TRAP染色，大量骨溶解導(dǎo)致的孔洞，周圍大量的破骨細(xì)胞聚集；而隨著AMF作用，骨溶解得到抑制，破骨細(xì)胞數(shù)量逐漸減少并呈現(xiàn)劑量依賴性

2.3 AMF所用濃度對BMMs無明顯的毒性作用CCK?8實(shí)驗(yàn)示：高濃度的AMF對BMMs細(xì)胞確有毒性作用，但0～10 μmol/L的AMF對BMMs不產(chǎn)生明顯的毒性（圖3）。

圖3 AMF對BMMs細(xì)胞活性的研究Fig.3 Study of amentoflavone on cell activity

2.4 AMF抑制體外破骨細(xì)胞的生成TRAP染色，0 μmol/L組可見大量的破骨細(xì)胞生成，隨著AMF濃度的增加，破骨細(xì)胞的數(shù)量及體積逐漸減少，10 μmol/L組幾乎看不到多核的破骨細(xì)胞（圖4）。

圖4 AMF抑制體外破骨細(xì)胞生成Fig.4 Amentoflavone restrain osteoclastogenesis in vitro

2.5 AMF抑制破骨細(xì)胞的功能骨片吸收實(shí)驗(yàn)示：0 μmol/L組骨片可見大量的深且大的骨陷窩，但隨著AMF濃度的增加，骨陷窩數(shù)量逐漸減少，10 μmol/L組只看到少量的骨陷窩（圖5）。

圖5 AMF抑制破骨細(xì)胞功能Fig.5 Amentoflavone restrain the function of osteolcast

2.6AMF阻斷MAPK通路ERK，JNK，p38蛋白磷酸化隨著RANKL誘導(dǎo)時(shí)間的延長出現(xiàn)不同程度增加，而當(dāng)AMF干預(yù)后，p?ERK、p?JNK、p?p38的表達(dá)受到了不同程度的抑制（圖6 A）。NFATc1和c?fos隨RANKL誘導(dǎo)時(shí)間逐漸增加，但經(jīng)AMF干預(yù)后，第3、5天蛋白表達(dá)被抑制（圖6）。

3 討論

醫(yī)學(xué)者一直在尋求方法來減少磨損顆粒的產(chǎn)生，如改良手術(shù)入路來增加術(shù)后假體穩(wěn)定性，優(yōu)化假體設(shè)計(jì)如三級假體，陶瓷假體等大大減少了磨損顆粒的產(chǎn)生［11］。然而先進(jìn)的假體不但費(fèi)用高昂，而且不能完全阻止磨損顆粒產(chǎn)生［12］。雖然抑制破骨細(xì)胞骨吸收藥物，如雙膦酸鹽類能收到一定效果，但是腎衰竭、下頜骨壞死等嚴(yán)重副作用限制了此類藥物的使用［13］。因此，尋找一種既能抑制破骨細(xì)胞的生成，又能減少藥物不良反應(yīng)的新藥是很有必要的。

圖6 AMF抑制MAPK信號通路及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)Fig.6 Amentoflavone inhibit MAPKs and key transcription factors

研究表明AMF具有成骨作用，但是關(guān)于AMF對破骨細(xì)胞生成及骨溶解的作用是第一次研究。顱骨掃描示腹腔注射AMF能夠抑制骨溶解并呈現(xiàn)劑量依賴性。假體周圍骨溶解是破骨細(xì)胞破壞所造成的［14］，顱骨切片示AMF能夠抑制破骨細(xì)胞的生成，進(jìn)一步觀察破骨細(xì)胞數(shù)量與顱骨骨質(zhì)破壞呈現(xiàn)一致性。因此我們猜想AMF是通過抑制破骨細(xì)胞生成而抑制了鈦顆粒誘導(dǎo)的骨溶解。

TRAP是破骨細(xì)胞的標(biāo)記蛋白［15］，隨著AMF干預(yù)劑量的增加，破骨細(xì)胞體外生成明顯受到抑制。骨溶解破骨細(xì)胞是導(dǎo)致骨破壞的根源［14］，因此設(shè)計(jì)骨片吸收實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證破骨細(xì)胞的功能。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)AMF干預(yù)后骨陷窩數(shù)量及深度逐漸減少，因此推斷AMF能夠抑制破骨細(xì)胞的生成及功能。CCK?8實(shí)驗(yàn)示采用的AMF濃度對BMMs無明顯的毒性作用，證明AMF不是通過對BMMs的毒性作用抑制了破骨細(xì)胞的生成及功能，而是通過其他作用。

研究表明MAPK信號通路在RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的生成及骨吸收功能起關(guān)鍵作用［6，8，16］。而JNK、ERK、p38分別對破骨細(xì)胞的分化、功能及存活起著關(guān)鍵作用［17］。因此，猜測AMF是否通過阻斷MAPK信號通路來抑制破骨細(xì)胞生成呢？研究發(fā)現(xiàn)RANKL介導(dǎo)的ERK、JNK、p38的磷酸化是短暫的［18］，實(shí)驗(yàn)選擇AMF干預(yù)后RANKL 30 min內(nèi)進(jìn)行誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMF能抑制RANKL介導(dǎo)的MAPKs相關(guān)蛋白的磷酸化。NFATc1和 c?fos是MAPK通路介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成重要的轉(zhuǎn)錄因子［19-20］。經(jīng)AMF干預(yù)后，NFATc1和c?fos蛋白的表達(dá)受到了不同程度的抑制，說明AMF可能通過抑制NFATc1和c?fos的表達(dá)阻斷MAPK信號通路。以上結(jié)果說明AMF能夠阻斷MAPK信號通路。綜上，筆者認(rèn)為AMF可能是通過阻斷MAPK通路抑制破骨細(xì)胞的生成及鈦顆粒誘導(dǎo)的小鼠顱骨骨溶解。

本研究不足。未設(shè)立陽性對照組來驗(yàn)證AMF的確切功效；實(shí)驗(yàn)采用的是工業(yè)顆粒，與人體內(nèi)的顆粒大小及數(shù)量很難模擬。

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