銀黃滴丸制劑提取物抗口腔潰瘍的藥效學(xué)研究

★劉新輝 孔小強(qiáng) 胡鵬翼 趙準(zhǔn) 沈漢福 吳建明 劉秀娟 廖正根 朱金華 高書(shū)亮 余日躍,3**（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004；.浙江維康藥業(yè)股份有限公司 浙江 麗水33000；3.江西省中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004）

口腔潰瘍（oral ulcer）是口腔黏膜病中最常見(jiàn)的疾病，患病率高達(dá)20%左右，居口腔粘膜病的首位。主要表現(xiàn)為口腔粘膜反復(fù)出現(xiàn)孤立的、圓形或橢圓形的潰瘍，潰瘍表淺，呈淡黃色，或白色，邊緣整齊，周?chē)@以紅暈，可單發(fā)或多發(fā)，有明顯的灼痛。發(fā)病不受年齡限制，以青年為多，女性略多于男性，一年四季均能發(fā)生，冬春季較多。動(dòng)物模型的建立是研究疾病病因、機(jī)制及治療等的重要手段，國(guó)內(nèi)外對(duì)口腔潰瘍動(dòng)物模型的建立做了大量的研究和論證［1］。口腔潰瘍模型的建立方法多樣，本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌感染誘導(dǎo)法和化學(xué)物質(zhì)灼燒法。

1 材料

1.1 動(dòng)物 日本大耳兔（南昌龍平兔業(yè)有限公司，許可證號(hào)scxk（贛）2014-0005），雌雄兼用，體重2kg左右。

1.2 設(shè)備 包埋機(jī)（EG1150，徠卡公司）；切片機(jī)（RM2235，徠卡公司）；倒置熒光顯微鏡（IBE2000，徠卡公司）；內(nèi)窺鏡等。

1.3 試藥與試劑 銀黃滴丸制劑前提取的金銀花提取物和黃芩提取物（浙江維康藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)：B160505）。梔子金花丸（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司樂(lè)仁堂制藥，批號(hào)：C145065）。金黃色葡萄球菌ATCC25923（江西省臨床檢驗(yàn)中心）、苯酚溶液。

2 方法

2.1 藥液配制

2.1.1 供試液 銀黃滴丸制劑提取物（金銀花∶黃芩=5∶2）成人臨床劑量為24mg/kg，按體表面積折算家兔劑量為78.4mg/kg。擬設(shè)家兔的低、中、高劑量分別為78.4、156.8和313.6mg/kg。梔子金花丸為陽(yáng)性藥，家兔劑量為420.43mg/kg。各藥液均用蒸溜水配成10mL/kg的混懸液，常溫保存，用前搖勻。

2.1.2 金黃色葡萄球菌溶液 取得金黃色葡萄球初始濃度為8.17×108cfu/mL，加生理鹽水稀釋至2.17×103cfu/mL，4℃冰箱儲(chǔ)存，備用。

2.2 口腔潰瘍的制備

2.2.1 感染性口腔潰瘍 取家兔48只，體重為2～3kg，雌雄各半，取40只家兔在其下牙床后部用鑷子造成黏膜20mm2左右的創(chuàng)傷，再用滴管滴一滴濃度為2.17×103cfu/mL的金黃色葡萄球菌溶液于創(chuàng)面，每日用沾有金黃色葡萄球菌溶液的鑷子刺激創(chuàng)面一次，連續(xù)3天，創(chuàng)面出現(xiàn)潰瘍面（白色或淡黃色假膜覆蓋）［2］，并用內(nèi)窺鏡拍照，記錄潰瘍面大小。其余8只家兔為空白對(duì)照。

2.2.2 化學(xué)物質(zhì)灼傷口腔潰瘍 另取家兔36只，體重為2～3kg，雌雄各半，從中取30只家兔造模，將一小棉球置于直徑為5mm的玻璃管一端（使之與管口平齊），再將玻璃管塞棉球一端蘸900g/L苯酚溶液，灼燒家兔左側(cè)面頰60s，24h后觀察，家兔口腔黏膜上均出現(xiàn)直徑5mm的潰瘍面［3］。內(nèi)窺鏡拍照，記錄潰瘍面大小。其余6只家兔為空白對(duì)照。

2.3 給藥與觀察 40只感染性口腔潰瘍家兔，隨機(jī)分為5組，分別為陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和模型組。另8只未造模為空白組。每組家兔按相應(yīng)劑量灌胃，給藥體積為10mL/kg，每天給藥一次，連續(xù)3天，模型組和空白組給相應(yīng)的蒸溜水。30只苯酚灼傷口腔潰瘍家兔，隨機(jī)均勻分為5組，分別為陽(yáng)性藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和模型組。另6只未造模為空白組。給藥方法同2.3，連續(xù)給藥6天。家兔給藥前拍照其潰瘍面，記錄其大小。治愈率%=（給藥前面積-給藥后面積/給面藥前面積）%。

2.4 病理觀察 給藥末次24h后處死家兔，剪取家兔潰瘍組織，生理鹽水洗凈組織，空白組同理操作。并分裝放入10%的中性甲醛中固定48h左右，分組，編號(hào)。組織進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋，以4μm厚度組織橫斷面切片，常規(guī)HE染色，組織封片，倒置熒光顯微鏡拍照觀察，記錄結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較組間差異，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 銀黃滴制劑提取物對(duì)家兔口腔潰瘍假膜的治療作用 對(duì)內(nèi)窺鏡照片進(jìn)行肉眼觀察，給藥前，各組家兔均在口腔破潰處有一塊面積較大的白色或淡黃色的假膜，說(shuō)明口腔潰瘍形成并非常明顯；與給藥第3天或第6天比較，除模型組外，其余各組家兔給藥后口腔潰瘍均出現(xiàn)一定的愈合，呈現(xiàn)顯著的藥效，而模型組有輕微的愈合。

3.2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)家兔口腔潰瘍面積的愈合作用 通過(guò)PS軟件對(duì)上述2.5內(nèi)窺鏡照片進(jìn)行治愈面積計(jì)算，從造模成功后開(kāi)始拍照記錄到給藥結(jié)束，治療過(guò)程中潰瘍恢復(fù)的程度，即為治愈率。分別計(jì)算金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治治愈率和化學(xué)物質(zhì)灼傷所致的口腔潰瘍治治愈率，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治愈率（，n=8）

表1 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致的口腔潰瘍治愈率（，n=8）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 給藥前面積/mm2給藥后面積/mm2 治愈率/%空白組 0.00±0.00 0.00±0.00** 0.00±0.00**模型組 19.58 ±2.67 13.44 ±2.9 31.16 ±13.18陽(yáng)性藥組 19.44 ±6.84 2.52 ±0.79** 84.53±7.53**低劑量組 19.56 ±8.45 8.19 ±2.62* 31.16 ±13.18*中劑量組 19.54 ±9.73 6.97 ±5.52** 67.98±21.38**高劑量組 20.17 ±22.00 5.37 ±3.85** 77.13±19.46**

表2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致的口腔潰瘍治愈率（，n=6）

表2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致的口腔潰瘍治愈率（，n=6）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 給藥前面積/mm2給藥后面積/mm2 治愈率/%空白組 0.00±0.00 0.00±0.00** 0.00±0.00**模型組 7.53±1.05 5.80±1.43 31.16 ±13.18陽(yáng)性藥組 7.39±1.04 3.62±1.14* 84.53±7.53**低劑量組 7.68±1.55 4.01±0.93* 31.16 ±13.18*中劑量組 7.43±1.56 2.96±0.93** 67.98±21.38**高劑量組 7.45±1.89 3.40±1.56* 77.13±19.46**

3.3 組織病理學(xué)

3.3.1 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍病理學(xué)影響 顯微鏡下放大10倍物鏡，觀察各組家兔潰瘍組織病理變化。結(jié)果表明，模型組上皮組織結(jié)構(gòu)不清晰，有變性、壞死、缺失，粘膜表面有炎性分泌物，并有血痂形成，粘膜下局部有充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組個(gè)別家兔局部皮下有充血現(xiàn)象；空白組無(wú)明顯病理性改變；低、中、高劑量組上皮有局部變性、壞死，粘膜下局部有充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.3.2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致家兔口腔潰瘍病理學(xué)影響 顯微鏡下放大10倍物鏡，觀察各組家兔潰瘍組織病理變化。結(jié)果表明，模型組粘膜層損傷明顯，上皮細(xì)胞脫落缺損，局部有細(xì)胞變性、壞死等病理性改變，粘膜及粘膜下可見(jiàn)充血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組病理性損傷明顯減輕，上皮組織無(wú)明顯壞死；空白組組織結(jié)構(gòu)正常，粘膜層完整無(wú)損；低、中、高劑量組病理性損傷減輕，上皮組織可見(jiàn)局部變性、壞死，局部粘膜下有充血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍病理學(xué)影響

圖2 銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致家兔口腔潰瘍病理學(xué)影響

4 討論

口腔潰瘍（oral ulcers）俗稱(chēng)“口瘡”，常見(jiàn)的發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥，多見(jiàn)于唇內(nèi)側(cè)、頰黏膜、前庭溝、軟腭等部位，這些部位的黏膜缺乏角質(zhì)化層或角化較差，從而易引起口腔潰瘍［3］。

銀黃滴丸制劑提取物的主要成分為金銀花和黃芩。金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。夏初花開(kāi)放前采收，干燥。具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱功能。主治癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風(fēng)熱感冒，溫病發(fā)熱［4］。趙良忠等［5］研究表明，金銀花提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、青霉、黃曲霉、黑曲霉有一定的一致作用，并研究表明，加熱處理可強(qiáng)化金銀花提取物的抑菌效果，確定了最佳工藝條件，金銀花提取物抑菌作用更為明顯。Lee等［6］證實(shí)了金銀花中的兩個(gè)單體化合物L(fēng)oniceroside A和Lonicerin具有顯著的抗炎止痛作用。

黃芩為唇形科植物黃芩Scutellariabaicalensis Georgi的干燥根。春、秋二季采挖，除去須根和泥沙，曬后撞去粗皮，曬干。具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎功能，主治血熱吐衄，癰腫瘡毒等［7］。Li等［8］將黃芩應(yīng)用于體外抗菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，黃芩對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等多種細(xì)菌均有一定的抑制作用。李倩楠等［9］研究表明，黃芩苷對(duì)發(fā)熱大鼠具有解熱作用，觀察藥后各組體溫變化率與IL-6、IL-1、βTNF-α含量變化率作相關(guān)性分析，結(jié)果表明黃芩苷有顯著的解熱作用，七解熱機(jī)制與TNF-α和IL-1β的含量減少密切的有關(guān)。

因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)合金銀花和黃芩的藥理作用對(duì)兩者聯(lián)合用藥，實(shí)驗(yàn)表明，銀黃滴丸制劑提取物對(duì)金黃色葡萄球菌所致家兔口腔潰瘍有明顯的治療作用。另一部分，雖兩藥在化學(xué)物質(zhì)灼傷所致家兔口腔潰瘍方面報(bào)道甚少，但通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，銀黃滴丸制劑提取物對(duì)化學(xué)物質(zhì)灼傷所致家兔口腔潰瘍也有明顯的治療作用。而在機(jī)制作用方面，根據(jù)Xiao Y等研究表明，Jinkoubao能大大改善家兔口腔癥狀并兔并促進(jìn)其愈合，作者認(rèn)為這可能是通過(guò)調(diào)節(jié)表皮生長(zhǎng)因子水平，加強(qiáng)口腔潰瘍的修復(fù)能力［10］。本實(shí)驗(yàn)僅銀黃滴丸制劑提取物對(duì)家兔進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究和藥效學(xué)研究，其在機(jī)制方面的作用有待進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn)

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［7］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典·一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010:283.

［8］Li Y C, Shen J D, Li J, et al. Chronic treatment with baicalin prevents the chronic mild stress-induced depressive-like behavior: involving the inhibition of cyclooxygenase-2 in rat brain [J]. Progress in Neuropsychopharmacology& Biological Psychiatry, 2013, 40(2):138-143.

［9］李倩楠,葛曉群.黃芩苷的解熱作用及對(duì)細(xì)胞因子的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2010, 35(8):1 068-1 072.

［10］Xiao Y, Chen Q, Su S, et al. Effect of Jinkoubao on rabbit oral ulcer model [J]. Chongqing Medicine, 2017, 46(7):886-888.