基于高效液相特征圖譜的桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

★鄧杏好 林明越 譚梅英（.佛山市順德區(qū)北滘醫(yī)院 廣東 佛山 58；.佛山市中醫(yī)院 廣東 佛山 58000；.廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院 廣州 50095）

桔梗（platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.），具有宣肺、祛痰、利咽、排膿之功效，臨床上常用其與其它藥味組方或以提取物用于祛痰、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等。桔梗含有多種化學(xué)成分，文獻(xiàn)報(bào)道顯示，桔梗總皂苷對A549 肺移植瘤組織生長有較好抑制作用，可能通過下調(diào)移植瘤組織STAT2 蛋白表達(dá)來抑制瘤組織的生長［1-4］。桔梗提取物、總皂苷等有效部位、現(xiàn)代化劑型的研發(fā)，促進(jìn)了功效導(dǎo)向的現(xiàn)代化開發(fā)。在此基礎(chǔ)上，將桔梗開發(fā)為中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑，可以增強(qiáng)使用的便利性，質(zhì)量的均一性，提高用藥效率［5］。

目前為止，對桔梗的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)，主要采用薄層色譜鑒別和高效液相色譜含量測定及指紋圖譜研究。標(biāo)準(zhǔn)湯劑系采用規(guī)范化工藝進(jìn)行提取和制備的固態(tài)中藥湯劑，出于使用需要，標(biāo)準(zhǔn)湯劑主要采用水或一定比例乙醇等對人體較為安全的溶劑進(jìn)行提取，與指紋圖譜研究中制備供試品的溶劑存在較大區(qū)別，故在制備過程中，仍需要對中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行指紋圖譜或者特征圖譜研究［6-8］。

1 儀器和材料

高效液相色譜（HPLC）分析采用Waters 2695高效液相色譜儀（美國），配備DAD檢測器；色譜柱為SUPERIOREX ODS C18（規(guī)格：4.6mm×250mm，5μm）（日本）。桔梗皂苷D對照品均購自中國食品藥品檢定研究院（中國）。HPLC分析所用乙腈為色譜純，購自Merck（德國）；其余試劑均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠（中國）。實(shí)驗(yàn)所用純凈水購自屈臣氏公司（中國）。桔梗藥材購自本地藥材市場。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC條件 流動(dòng)相采用乙腈-0.2%甲酸水溶液（v/v），乙腈為A相，甲酸水溶液為B相，梯度洗脫，程序 為：0～10min，10%～10%A；10～45min，10%～15%A；45～85min，15%～30%A ；85～104min，30%～90%A ；104～105min，90%～10%A。 流 速 1.0mL/min，進(jìn) 樣 量10μL，檢測波長203nm，柱溫25℃。

2.2 樣本制備 以桔梗皂苷D為參照物，備方法為，精密稱取桔梗皂苷對照品適量，置5mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，即得每毫升含桔梗皂苷D1mg/mL的儲(chǔ)備溶液。精密吸取上述儲(chǔ)備溶液0.5mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得濃度為50μg/mL的桔梗皂苷D參照物溶液。

供試品的制備方法為，精密稱取桔梗藥材5g，加10倍量水煎煮兩次，每次1h，合并所得溶液，濾過，濾液濃縮至相對密度約為1.2的稠膏，冷凍干燥，凍干粉裝入西林瓶中密封，即得桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑。精密稱取上述標(biāo)準(zhǔn)湯劑約0.2g，加20%乙醇超聲30min，以0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 特征圖譜建立 取“2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液，共制備10批，照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC分析，記錄各共有峰的保留時(shí)間及峰面積，以桔梗皂苷D（峰3）為參照峰S，計(jì)算相對保留時(shí)間，相對峰面積和相似度。結(jié)果顯示，桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑共8個(gè)特征峰，相對保留時(shí)間的RSD為0.43%～0.86%，相對峰面積的RSD為6.54%～27.07%，10批標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜的相似度均在0.9以上，表明所制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑較為穩(wěn)定。根據(jù)上述結(jié)果，相對保留時(shí)間偏差較小，相對峰面積偏差較大，故僅采用相對保留時(shí)間作為方法學(xué)考察的指標(biāo)。

圖1 桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑代表性特征圖譜（A）和桔梗皂苷D對照品色譜圖（B），其中3（S）為桔梗皂苷D

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC分析，重復(fù)測定6次，記錄特征圖譜，計(jì)算各特征峰相對保留時(shí)間，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，各特征峰保留時(shí)間RSD在0.05%～0.88%之間，表明方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性考察 取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共平行制備6份，照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC分析，記錄特征圖譜，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，各特征峰保留時(shí)間RSD在0.08%～0.81%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法，于0、1、2、4、8、12、24h進(jìn)HPLC分析，記錄特征圖譜，計(jì)算各特征峰的相對保留時(shí)間，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，各特征峰保留時(shí)間RSD在0.09%～0.82%之間，表明所制備供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 含量測定方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性 取桔梗皂苷D參照物溶液適量，分別置不同10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得桔梗皂苷D含量分別為5、10、50、100、200、500μg/mL的溶液。照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC分析，記錄桔梗皂苷D峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)x，峰面積為縱坐標(biāo)y，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=2430.5x-12452（r=0.9991），表明方法線性良好。

2.5.2 精密度和加樣回收率考察 精密度的考察方法為，取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC分析，重復(fù)測定6次，記錄桔梗皂苷D峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，桔梗皂苷D的RSD為1.75%，表明方法精密度良好。

加樣回收率的考察方法為，取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，分為高、中、低三個(gè)濃度，分別精密加入桔梗皂苷D對照品溶液適量（具體情況見表1），照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（除稱取標(biāo)準(zhǔn)湯劑量改為0.1g），照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC分析，每個(gè)濃度樣品測定3次，記錄桔梗皂苷D峰面積，計(jì)算含量、回收率和RSD，結(jié)果顯示，平均回收率為101.1%，RSD為2.56%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.3 重復(fù)性考察 取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑，照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共平行制備6份，照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC分析，記錄桔梗皂苷D峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，RSD為2.71%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性考察 取同一批標(biāo)準(zhǔn)湯劑， “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法，于0、1、2、4、8、12、24h進(jìn)HPLC分析，記錄特征圖譜，計(jì)算桔梗皂苷D峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，RSD為2.37%，表明所制備供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 含量測定與轉(zhuǎn)移率 取桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑，照《中國藥典》2015年版一部桔?！昂繙y定”項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品處理及HPLC分析［9］，記錄峰面積，計(jì)算桔梗皂苷D的含量，結(jié)果顯示（表2）桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑中，桔梗皂苷D的平均含量為3.32mg/g，RSD為27.01%，轉(zhuǎn)移率在12.24%～42.57%之間，表明本研究所用制備方法能夠較為高效地將桔梗中的主要活性成分提取出來。

表1 10批桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑與藥材量對應(yīng)表

表2 10批桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量測定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果

3 討論

3.1 桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征峰歸屬 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，桔梗中含有多種類型的化學(xué)成分。然而，筆者在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，除桔梗皂苷D外，并未發(fā)現(xiàn)其余已有文獻(xiàn)報(bào)道的成分在特征圖譜中得到指認(rèn)，其原因可能與桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法有關(guān)：由于標(biāo)準(zhǔn)湯劑嚴(yán)格使用制備傳統(tǒng)中藥湯劑所用溶劑（水），所得提取液中，由于溶劑極性的顯著差異，導(dǎo)致所含化學(xué)成分的顯著差異。因此，在制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑的過程中，易溶于水的成分較其它成分更易提取。為進(jìn)一步明確桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分信息，應(yīng)在后續(xù)研究中進(jìn)一步對各特征峰進(jìn)行分離、純化和鑒定，以期發(fā)現(xiàn)更多與功效主治相關(guān)的活性成分。

3.2 桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑提取效率分析 以桔梗皂苷D 的含量作為指標(biāo)，由表2可知，桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的提取效率在可接受范圍內(nèi)，提示本研究所用提取方法能夠?qū)⒔酃Ｔ碥誅從桔梗藥材中有效提取出來。然而，桔梗皂苷D僅為桔梗眾多成分的其中一個(gè)，除此之外尚未有其它特征峰得到鑒別。為更準(zhǔn)確評價(jià)桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量，應(yīng)考慮繼續(xù)對上述峰進(jìn)行指認(rèn)。

4 討論

本研究對桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行了含量測定和特征圖譜研究，本方法準(zhǔn)確、全面、可靠，能夠?qū)酃?biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，為后續(xù)桔梗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高奠定技術(shù)基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明，將桔梗藥材經(jīng)提取和冷凍干燥制成標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉后，轉(zhuǎn)移率（以桔梗皂苷D含量計(jì)）較為適宜，臨床應(yīng)用無需加大劑量，同時(shí)可發(fā)揮標(biāo)準(zhǔn)湯劑便于攜帶、調(diào)配和使用的特點(diǎn)，是現(xiàn)行中藥方劑使用的重要補(bǔ)充。

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