頭孢噻呋納米乳的制備及其抗奶牛乳腺炎主要致病菌的研究

梁思源，王越珉，胡松華

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，杭州310058）

奶牛乳腺炎是由病原菌引起的乳腺組織炎癥，在炎癥過(guò)程中乳腺組織受到破壞，泌乳量下降，是造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)效益損失最嚴(yán)重的疾病之一。乳房?jī)?nèi)灌注抗菌藥物是治療奶牛乳腺炎、清除乳腺感染的常用方法。然而，在臨床實(shí)踐中該方法對(duì)奶牛乳腺炎的治療效果并不理想。除了細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性之外，另一個(gè)原因可能是給藥后藥物和病原菌在乳腺內(nèi)的分布不一致。曹立亭等[1]的研究提出，由于牛乳含乳脂成分，水溶性抗菌藥物在乳房?jī)?nèi)灌注后趨向于往下分布，而病原菌往往附著在乳脂中趨向于分布在乳房的上部，二者不能充分接觸，使藥物的抗菌作用降低。頭孢噻呋（ceftiofur）是第3代動(dòng)物專(zhuān)用頭孢類(lèi)抗生素，其抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）也有較好的抗性作用[2]。為了提高臨床使用效率，將不溶于水的頭孢噻呋改造成頭孢噻呋鈉（ceftiofur sodium,CS）溶解在水中供臨床使用。為克服水溶性藥物在奶牛乳房灌注后不能和病原菌充分接觸的問(wèn)題，本研究將頭孢噻呋制成一種穩(wěn)定的納米乳劑，研究頭孢噻呋納米乳（ceftiofur nanoemulsion,CNE）在牛乳中的分布及對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠的治療作用，為臨床治療奶牛乳腺炎提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌ATCC 29740株和ATCC 25923株、大腸埃希菌ATCC 25922株均由浙江大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

吐溫-80、甘油購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；注射用大豆油由浙江田雨山藥用油有限公司生產(chǎn)；頭孢噻呋由武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司生產(chǎn)；頭孢噻呋鈉由齊魯動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)；碳酸氫鈉、二甲基亞砜購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MH（Mueller-Hinton）液體培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；牛乳（細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陰性）由浙江省杭州市杭江奶牛場(chǎng)生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR雌性小鼠（18～22 g），由江蘇新藥研究中心有限公司提供。

1.1.4 儀器

85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（杭州儀表電機(jī)有限公司）；SK8210HP型超聲波清洗（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；NDJ-8S型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)（上海昌吉地質(zhì)儀器有限公司）；Nano-ZS型納米粒度電位分析儀（英國(guó)馬爾文儀器有限公司）；MaxQ6000型恒溫冷凍搖床（美國(guó)Thermo Fisher科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 頭孢噻呋納米乳的制備

為篩選出合適的納米乳配方，將吐溫-80和甘油按質(zhì)量比1∶0、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1混合作為乳化劑，再分別將這5種乳化劑與注射用大豆油按質(zhì)量比9.75∶0.25、9.5∶0.5、9.25∶0.75、9∶1、8.75∶1.25、8.5∶1.5、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5混合，邊攪拌邊緩慢加入水相。隨著水相的增加，體系逐漸變稠，變渾濁，達(dá)到臨界點(diǎn)后又逐漸變稀，直至形成澄清透明的液體；記錄體系由黏稠轉(zhuǎn)變至澄清的臨界值。以水相、油相和乳化劑分別作為三相，運(yùn)用Origin 8.0軟件制作偽三元相圖，標(biāo)定臨界點(diǎn)的質(zhì)量比來(lái)確定納米乳形成區(qū)間，考察區(qū)間的面積大小以確定易形成穩(wěn)定納米乳的范圍。

在此基礎(chǔ)上，制備12.5 mg/mL頭孢噻呋納米乳。具體步驟為：在20～25℃下，用200μL二甲基亞砜溶解125 mg頭孢噻呋后與0.58 g大豆油混合均勻，加入吐溫-80（3.12 g）和甘油（1.56 g）組成的乳化劑中，磁力攪拌5 min使其混合均勻，轉(zhuǎn)至超聲儀中水浴超聲15 min（控制超聲溫度＜40℃），然后用磁力攪拌器邊攪拌邊緩慢滴加5.5 g去離子水，直至水相完全加入到體系中，最后再轉(zhuǎn)至超聲儀中超聲處理10 min，即得頭孢噻呋納米乳。

1.2.2 頭孢噻呋納米乳性狀檢驗(yàn)

乳劑類(lèi)型檢測(cè)：分別用水溶性染料亞甲藍(lán)和脂溶性染料蘇丹紅Ⅲ進(jìn)行染色，比較其在納米乳中的擴(kuò)散速度。若亞甲藍(lán)擴(kuò)散速度大于蘇丹紅Ⅲ，則說(shuō)明制得的頭孢噻呋納米乳為水包油型；反之，則為油包水型[3]。

穩(wěn)定性檢測(cè)：取10 mL制得的納米乳經(jīng)1.2萬(wàn)r/min離心15 min后，觀察分層和藥物析出現(xiàn)象；用去離子水對(duì)納米乳分別稀釋5、10、20、40倍，觀察分層和沉淀現(xiàn)象；將納米乳在121℃高壓蒸汽滅菌15 min后恢復(fù)到室溫，觀察沉淀和分層現(xiàn)象。

流動(dòng)性檢測(cè)：在20℃室溫下，用NDJ-8S型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定納米乳的黏滯度。

粒徑檢測(cè)：用Nano-ZS型納米粒度電位分析儀測(cè)定頭孢噻呋納米乳的粒徑分布及Zeta電位分布，測(cè)定溫度為25℃。

1.2.3 頭孢噻呋納米在牛乳中的分布

參照曹立亭等[1]的方法，用生理鹽水稀釋頭孢噻呋納米乳和頭孢噻呋鈉，將這2種藥物質(zhì)量濃度調(diào)整至31.25和15.625μg/mL。在盛有48 mL無(wú)菌牛乳的圓柱形塑料管（直徑27 mm、高100 mm）中加入1 mL藥物溶液和1 mL細(xì)菌懸液（金黃色葡萄球菌ATCC 29740株或大腸埃希菌ATCC 25922株，2.5×107CFU/mL），充分混勻，使細(xì)菌最終濃度為5×105CFU/mL，抗菌藥物最終質(zhì)量濃度為0.625μg/mL（金黃色葡萄球菌）或0.312 5μg/mL（大腸埃希菌），垂直于地面在37℃靜置培養(yǎng)12 h后，置于-20℃冰箱冷凍8 h，將冰柱分割成上、中、下3等份，融化后用生理鹽水稀釋。取各部分稀釋的含菌牛乳100μL涂布于MH瓊脂平板，每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)，于37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)（參考GB 4789.2—2016）。

1.2.4 頭孢噻呋納米乳對(duì)感染金黃色葡萄球菌小鼠的治療處理

將70只雌性ICR小鼠（18～22 g）隨機(jī)分成7組，每組10只。每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.4 mL金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）懸液（5×109CFU）。3 h后小鼠出現(xiàn)精神不振、抱團(tuán)、呼吸急促、鼠毛蓬亂等癥狀。第1～3組的每只小鼠一次肌內(nèi)注射頭孢噻呋鈉（CS），劑量分別為19.1、38.2和57.3 μmol/kg；第4～6組的每只小鼠一次肌內(nèi)注射頭孢噻呋納米乳（CNE），劑量分別為19.1、38.2和57.3 μmol/kg；第7組小鼠僅肌內(nèi)注射0.1 mL生理鹽水，作為對(duì)照組。觀察感染后120 h內(nèi)各組小鼠的死亡情況。

圖1 納米乳配方偽三元相圖Fig.1 Pseudo ternary phasediagram of different nanoemulsion formulas

2 結(jié)果與分析

2.1 納米乳配方篩選

為了使體系在形成澄清納米乳的同時(shí)，油相占比達(dá)到最大值，我們繪制了5個(gè)配方的偽三元相圖以觀察各種不同成分配比形成的納米乳區(qū)域面積（圖1黑色部分）。從中可以看出，配方4（Km=2∶1）的黑色面積最大，說(shuō)明能形成澄清透明納米乳的范圍最大。在油相比例最大時(shí)，各組分占比分別是大豆油7.35%，吐溫-80 34.29%，甘油17.18%和水41.18%。

2.2 頭孢噻呋納米乳的性狀

頭孢噻呋納米乳外觀為淡黃色澄清透明均一液體。親水性染料亞甲藍(lán)在納米乳中擴(kuò)散迅速，而疏水性染料蘇丹紅Ⅲ在納米乳中基本不擴(kuò)散，表明頭孢噻呋納米乳為水包油型。經(jīng)5、10、20和40倍稀釋后液體仍保持澄清，無(wú)渾濁或分層現(xiàn)象；經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌15 min后放置于室溫，液體顏色顯著加深，變渾濁，表明不能耐受高壓滅菌；經(jīng)1.2萬(wàn)r/min離心15 min后，液體無(wú)分層和沉淀。在20℃時(shí)，頭孢噻呋納米乳的黏滯度為371 mPa·s。在25℃時(shí)，頭孢噻呋納米乳的平均粒徑為60.54 nm，呈單峰分布（圖2）；測(cè)得的聚合物分散系數(shù)（polymer dispersity index,PDI）為0.161，表明分布范圍較窄。Zeta電位分布（圖3）顯示，峰1均值為-5.11 mV（88.8%），峰2均值為36.0 mV（11%）。

2.3 頭孢噻呋納米乳和頭孢噻呋鈉對(duì)不同部分牛乳菌落計(jì)數(shù)的影響

表1中的結(jié)果顯示：在用頭孢噻呋納米乳（CNE）處理的牛乳中，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的菌落數(shù)由下而上逐漸減少；而在頭孢噻呋鈉（CS）處理的牛乳中，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的菌落數(shù)由下而上逐漸增加。

圖2 頭孢噻呋納米乳粒徑分布Fig.2 Droplet sizedistribution of ceftiofur nanoemulsion

圖3 頭孢噻呋納米乳Zeta電位分布Fig.3 Zetapotential distribution of ceftiofur nanoemulsion

表1 頭孢噻呋納米乳和頭孢噻呋鈉對(duì)上、中、下部牛乳中細(xì)菌數(shù)量的影響Table1 Effectsof CNEand CSon bacterial countsin threepartsof milk lg(CFU/mL)

2.4 頭孢噻呋納米乳和頭孢噻呋鈉治療對(duì)感染金黃色葡萄球菌小鼠存活率的影響

由圖4可知：對(duì)照組小鼠感染金黃色葡萄球菌后的最終存活率為0%；120 h后，用頭孢噻呋鈉3個(gè)劑量（19.1、38.2或57.3μmol/kg）治療的小鼠存活率依次為40%、50%和70%；用頭孢噻呋納米乳3個(gè)劑量（19.1、38.2或57.3μmol/kg）治療的小鼠存活率依次為40%、70%和80%。

圖4 頭孢噻呋納米乳和頭孢噻呋鈉治療后金黃色葡萄球菌感染小鼠的存活率Fig.4 Survival rates of mice infected S.aureus after treatments with ceftiofur nanoemulsion and ceftiofur sodium

3 討論

納米乳是指粒徑范圍在1～100 nm，由水相、油相、表面活性劑、助表面活性劑等組成的均一穩(wěn)定體系[4]。水包油型納米乳可用于難溶性藥物的增溶。本研究將不溶于水的頭孢噻呋制成水包油型納米乳，便于灌注和注射[5]。制備納米乳所選表面活性劑需滿(mǎn)足乳化性能好、安全、無(wú)毒、無(wú)刺激等要求[6]。由于非離子表面活性劑可以在廣泛的pH范圍內(nèi)發(fā)揮作用，受體系中無(wú)機(jī)鹽、電解質(zhì)、酸、堿的影響較小，毒性和刺激性小，被廣泛應(yīng)用于納米乳的制備中[7]。吐溫-80在聚山梨醇酯類(lèi)中安全性最好，親水親油平衡（hydrophilic lipophilic balance,HLB）值為15，增溶作用和乳化作用較好，適用于制作水包油型納米乳[8]。助表面活性劑可以降低界面張力，增加界面的流動(dòng)性，調(diào)節(jié)HLB值，使納米乳可以自發(fā)形成[9-10]。本研究隨著體系中加入助表面活性劑甘油的比例逐漸增加，能形成納米乳的范圍逐漸增大，當(dāng)Km值為2∶1時(shí)范圍最大，且轉(zhuǎn)相時(shí)臨界狀態(tài)的黏滯度也降低，便于制備；當(dāng)Km值為1∶1時(shí)，體系變得不穩(wěn)定，可形成納米乳的范圍反而降低。納米乳的外觀一般為澄清透明或半透明，有藍(lán)色乳光，平行光入射有丁達(dá)爾現(xiàn)象，高速離心后穩(wěn)定[11]。納米乳的粒徑會(huì)影響藥物吸收的速率，乳滴粒徑越小，油水界面的面積越大，則納米乳的吸收越好[12]。本研究發(fā)現(xiàn)納米乳不能耐受高壓滅菌，可以通過(guò)0.22μm濾菌膜，因此，在生產(chǎn)中可以用過(guò)濾的方法除菌。

牛乳中的乳脂以脂肪球的形式分散在牛乳中，乳脂肪球密度較低，多分布于牛乳的上部。有研究表明，乳脂肪球有黏附大腸埃希菌的功能，這可能是病原菌在牛乳中更多分布于上部的原因之一[13]。本研究將抗菌藥物和細(xì)菌在牛乳中培養(yǎng)，對(duì)上、中、下不同部位的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，比較頭孢噻呋納米乳和頭孢噻呋鈉在牛乳中不同部位的抗菌作用。結(jié)果顯示，頭孢噻呋納米乳對(duì)2種受試菌株的抗菌作用均優(yōu)于頭孢噻呋鈉，且對(duì)細(xì)菌分布最多的牛乳上部抗菌作用顯著優(yōu)于中、下部，而頭孢噻呋鈉組的結(jié)果則相反。這可能與2組藥物在牛乳中的分布不同有關(guān)。

本研究以頭孢噻呋鈉或頭孢噻呋納米乳治療感染金黃色葡萄球菌小鼠均可顯著提高其存活率。存活率大小與用藥劑量有關(guān)，也與藥物的劑型有關(guān)。有研究報(bào)道，以20 mg/kg頭孢噻呋鈉治療經(jīng)30 mg/kg脂多糖攻毒的小鼠，小鼠存活率從0%提高至70%[14]。本研究在相同劑量下，用頭孢噻呋納米乳治療的小鼠存活率高于頭孢噻呋鈉治療組，說(shuō)明納米乳更具優(yōu)越性。

4 結(jié)論

本研究制備的頭孢噻呋納米乳穩(wěn)定性好，在牛乳中主要分布于上部。在相同劑量下，頭孢噻呋納米乳對(duì)感染金黃色葡萄球菌小鼠的治療作用優(yōu)于頭孢噻呋鈉。

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