利用電化學(xué)法結(jié)合絲素膜調(diào)控羥基磷灰石沉積及其形貌

王天云，張青，朱良均，楊明英

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院應(yīng)用生物資源研究所，杭州310058）

羥基磷灰石（hydroxyapatite,HAp）是人體骨組織中的主要無機(jī)成分，具有良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，在骨組織工程領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。研究表明，HAp的形貌、顆粒大小、形狀等對(duì)其成骨性具有很大影響。天然骨組織中的羥基磷灰石是在體內(nèi)鈣離子、磷酸根離子與天然膠原蛋白相互作用下形成的針狀納米顆粒[1]。如何利用有機(jī)分子和無機(jī)離子的相互作用制備出具有良好的促干細(xì)胞分化及成骨性的HAp形貌是骨組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[2]。

絲素蛋白（silk fibroin,SF）是一種性能優(yōu)良且容易獲取的天然高分子，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)由一系列小的疏水性氨基酸及親水性大側(cè)鏈氨基酸組成。這種組分和結(jié)構(gòu)賦予了絲素蛋白易于降解、結(jié)構(gòu)可控和良好的生物相容性等特性[3]。隨著生物材料的發(fā)展，絲素蛋白已經(jīng)在組織工程、腫瘤治療和檢測(cè)及納米醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到了應(yīng)用和實(shí)踐。絲素蛋白本身所具有的羧基能很好地結(jié)合鈣離子，進(jìn)而調(diào)控HAp的形成及形貌。研究表明，絲素纖維和絲素蛋白膜在HAp礦化液中能很好地調(diào)控HAp的成核和生長(zhǎng)，所得到的各種形貌的HAp能表現(xiàn)出不同的生物相容性和骨誘導(dǎo)活性，從而促進(jìn)骨修復(fù)[3-4]。

目前，絲素纖維或絲素膜調(diào)控HAp的沉積形貌通常是在模擬體液中通過自然礦化的方式完成。該方法雖然工藝條件溫和，但制備周期過長(zhǎng)，一般需要7 d的礦化才能實(shí)現(xiàn)HAp完全覆蓋材料表面[5]。電化學(xué)沉積HAp技術(shù)是一種利用電場(chǎng)從電解液中沉積粒子到導(dǎo)電基體上從而得到HAp涂層的方法。其簡(jiǎn)要原理是：在通電的情況下，陰極表面由于水的電解，產(chǎn)生氫氣，導(dǎo)致局部pH隨電流強(qiáng)度的增大而升高；在較高pH下，電解液中的Ca2+和H2PO4-與溶液中的OH-反應(yīng)，導(dǎo)致溶液局部過飽和，當(dāng)飽和程度達(dá)到磷酸鈣鹽化合物溶解度時(shí)，在陰極上即可沉積出相對(duì)應(yīng)條件的磷酸鈣鹽涂層[6]。由于其工藝溫和、非直線涂覆及可控性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此，近年來在仿生礦化HAp涂層中廣受采用，并能獲得形貌各異的HAp涂層[7]。

本文擬結(jié)合絲素蛋白和電化學(xué)沉積對(duì)HAp形貌的調(diào)控能力，通過改變沉積過程中的工藝參數(shù)，以期制備出具有良好生物相容性和成骨性能的HAp形貌，為HAp和HAp/SF復(fù)合材料在骨修復(fù)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

試驗(yàn)儀器：1702型電子分析天平（Sartorius GMBHGottingen公司，德國(guó)）、CH8660型電磁爐（客浦公司）、MD44透析袋（8～4 kDa）、GZX-9140MBE型數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、8400s型傅里葉紅外光譜儀（Shimadzu公司，日本）、SIRO型掃描電子顯微鏡（FEI公司，荷蘭）、IVIUM電化學(xué)系統(tǒng)（基本型，荷蘭）。

試驗(yàn)材料：家蠶繭，由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院應(yīng)用生物資源研究所提供；無水Na2CO3、溴化鋰（LiBr）購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；NaOH、Ca(NO3)2·4H2O、HNO3、(NH4)2HPO4、丙酮、乙醇均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

圖1 基底表面電化學(xué)沉積HAp涂層原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of HAp coating on basement surface by electrochemical deposition

1.2 方法

1.2.1 再生絲素蛋白溶液的制備

蠶繭脫膠處理：將1 cm2大小的繭殼放入0.01 g/mL Na2CO3溶液中煮沸30 min，重復(fù)1次后，用清水洗凈并干燥得到脫膠的絲素纖維；然后將脫膠的絲素纖維按0.1 g/mL浸沒于9.3 mol/L的LiBr溶液中，60℃水浴3 h，使絲素纖維完全溶解；隨后經(jīng)透析、濃縮得到合適濃度的再生絲素溶液，備用。

1.2.2 HAp在SF膜表面的電化學(xué)沉積

采用電化學(xué)暫態(tài)法模式和三電極體系，以SF/Ti片為陰極，鉑環(huán)為陽極，電解液體系為Ca(NO3)2和NH4H2PO4，在室溫下進(jìn)行電化學(xué)沉積。該過程的原理如圖1所示。沉積涂層經(jīng)去離子水沖洗后，自然晾干，用于后續(xù)檢測(cè)表征。

鈦（Ti）基體預(yù)處理[8]：采用4 cm×5 cm×1 mm的鈦板作為金屬基體，經(jīng)砂紙磨光，去離子水清洗后，置于HF和HNO3混合溶液[V(HF)∶V(HNO3)=1∶3]中酸洗10 min，再置于丙酮和乙醇混合溶液[V(丙酮)∶V(乙醇)=1∶1]中超聲清洗15 min，用去離子水保存待用。

SF/Ti板復(fù)合電極的制備：在鈦板電極上滴加絲素蛋白溶液，自然條件下風(fēng)干后，用75%乙醇處理使其β化；將貼合了絲素膜的鈦板作為陰極電極，采用電化學(xué)暫態(tài)法在SF/Ti板復(fù)合板上進(jìn)行HAp的電化學(xué)沉積。

電解液的制備：配制0.042 mol/L Ca(NO3)2·4H2O和0.025 mol/L(NH4)2HPO4的混合溶液作為電解液，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值。

1.3 HAp的表征

HAp形貌觀察：利用SIRON型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM）表征沉積的HAp形貌。首先在電鏡板上貼合導(dǎo)電膠，將制備好的樣品黏合于導(dǎo)電膠上，進(jìn)行噴金處理后用于SEM觀察。

HAp元素組成表征：通過SEM的電子能譜分析（electron diffraction spectroscopy,EDS）檢測(cè)沉積HAp的元素組成。

HAp晶相分析：采用XPert Powder型X射線衍射儀（帕納科公司，荷蘭），對(duì)基底上所沉積的HAp粉末進(jìn)行物相分析。測(cè)試條件為：管電壓40 kV，管電流40 mA，掃描速率5（°）/min，衍射角范圍0～90 °。

HAp化學(xué)結(jié)構(gòu)表征：采用傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR）分析沉積HAp的化學(xué)結(jié)構(gòu)。將樣品與溴化鉀（KBr）以質(zhì)量比1∶100混合，用研缽研磨成粉后置于50℃烘箱中烘干2 h，最后壓成薄片進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)定儀器掃描范圍為400～4 000 cm-1。

圖2 沉積前后SF/Ti板表面圖Fig.2 Images of SF/Ti plate surface before and after electrochemical deposition

2 結(jié)果與討論

2.1 沉積時(shí)間對(duì)HAp形貌的影響

從圖2中可以看出，在電化學(xué)沉積初期，表面有白色物質(zhì)形成，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，涂層明顯加厚且更均勻。

圖3為沉積電流密度1.5 mA/cm2、電解液pH 4.7，電化學(xué)沉積時(shí)間分別為1、5、10、20、30、35、45和60 min時(shí)所得到的HAp涂層形貌。從中可知：在沉積時(shí)間為1 min時(shí)，涂層形貌初步形成，呈塊狀平臺(tái)，伴隨有小顆粒沉積（圖3A）；當(dāng)沉積時(shí)間為5 min時(shí)，出現(xiàn)多孔平面，能觀察到脊?fàn)罱Y(jié)構(gòu)以及小顆粒的球狀團(tuán)簇晶體（圖3B）；10 min時(shí)的球狀團(tuán)簇晶體變多，可以看到球表面有均勻突出的針尖（圖3C）；20 min時(shí)，觀察到的涂層結(jié)構(gòu)為多孔平面上生長(zhǎng)著球狀團(tuán)簇晶體，其上的針尖開始交錯(cuò)，整體形似花簇花枝（圖3D）；當(dāng)沉積時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，可以看到平整多孔涂層，孔隙較為均一（圖3E）；當(dāng)時(shí)間延長(zhǎng)至35 min時(shí)，涂層表面在30 min形貌基礎(chǔ)上出現(xiàn)新生花簇形沉積，散落在多孔平臺(tái)表面（圖3F）；到45 min時(shí)，球狀團(tuán)簇晶體在形貌頂端聚集，趨向于形成新的多孔平面（圖3G）；最后在60 min時(shí)，在電鏡圖中可以觀察到規(guī)則花簇狀沉積的突起（圖3H）。這表明在不同沉積時(shí)間下，HAp在SF/Ti板表面以多層累積的方式沉積。

從上述變化中可知，當(dāng)沉積時(shí)間為1 min時(shí)沉積形貌初步形成，隨著時(shí)間延長(zhǎng)至30 min時(shí)，絲素蛋白膜表面可以礦化出均勻平整的多孔結(jié)構(gòu)，這種均一可控的形貌是后續(xù)促干細(xì)胞分化及成骨的理想形貌[9]。因此，1 min和30 min為研究電流密度和電解液pH對(duì)沉積形貌影響的最佳時(shí)間點(diǎn)。

2.2 電流密度和電解液p H值對(duì)HAp形貌的影響

為進(jìn)一步探討電解液pH與電流密度對(duì)HAp形貌的影響，觀察了當(dāng)沉積時(shí)間為1 min時(shí)，不同電流密度與電解液pH下涂層的電鏡形貌（圖4）。當(dāng)沉積電流密度為1.5 mA/cm2、電解液pH為4.7時(shí)，可以觀察到納米球狀涂層（圖4A）。當(dāng)沉積電流密度為1.5 mA/cm2、電解液pH為5.3時(shí)，涂層主要以塊狀沉積為主（圖4B），與常規(guī)的納米羥基磷灰石球狀沉積不同。當(dāng)沉積電流密度為2.5 mA/cm2、電解液pH為4.7時(shí)，所得的涂層呈現(xiàn)尚未完全的多孔平面形貌（圖4C）。當(dāng)沉積電流密度為2.5 mA/cm2、電解液pH為5.3時(shí)，所得涂層形成了花瓣堆疊形貌（圖4D）。

當(dāng)沉積時(shí)間為30 min時(shí)，不同沉積電流密度與電解液pH下涂層的電鏡形貌如圖5所示。當(dāng)電流密度為1.5 mA/cm2、電解液pH為4.7時(shí)，涂層表面呈現(xiàn)為多孔結(jié)構(gòu)，孔隙較為均一（圖5A）。當(dāng)電流密度為1.5 mA/cm2、電解液pH為5.3時(shí)，觀察到的涂層形貌為一多孔平面，孔隙較為均一，部分區(qū)域?yàn)槠交砻妫▓D5B）。當(dāng)電流密度為2.5 mA/cm2、電解液pH為4.7時(shí)，涂層平面已經(jīng)生長(zhǎng)完全，在電鏡圖上可以觀察到平面表面分布著大量無規(guī)則多孔（圖5C）。而電流密度為2.5 mA/cm2、電解液pH為5.3時(shí)，可以觀察到均勻多孔平面，且孔隙為均一的納米孔（圖5D）。

圖4 沉積時(shí)間1 min時(shí)不同沉積電流密度及電解液p H下HAp的電鏡圖Fig.4 SEM imagesof HAp depostied for 1 min under different ampere densities and electrolyte pH

圖5 沉積時(shí)間30 min時(shí)不同沉積電流密度及電解液p H下HAp的電鏡圖Fig.5 SEM images of HAp deposited for 30 min under different amperedensitiesand electrolytepH

2.3 沉積HAp涂層成分、晶相及化學(xué)結(jié)構(gòu)的表征

通過觀察不同沉積時(shí)間、電流密度和電解液pH下所沉積的HAp電鏡圖可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電解液pH為5.3、電流密度為2.5 mA/cm2、沉積時(shí)間為30 min時(shí)，可以得到具有理想結(jié)構(gòu)的沉積涂層，此時(shí)的涂層孔隙均勻，表面平整。因此，本研究利用EDS能譜分析、X射線衍射（X-ray diffraction,XRD）分析及FTIR分析對(duì)該涂層的成分、晶相組成及化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了進(jìn)一步表征。EDS能譜結(jié)果（表1）表明，在沉積的白色粉末中Ca/P約為1.8，與胡仁等[10]的結(jié)果（Ca/P為1.67）較為接近。

圖6A為沉積HAp的FTIR圖譜。從中可觀察到，在3 000～3 600 cm-1處H2O中OH-有伸縮振動(dòng)峰，在1 640 cm-1處純HAp結(jié)合水有伸縮振動(dòng)峰。研究證明，在1 400 cm-1處有碳酸根伸縮振動(dòng)峰[11]，1 000～1 200 cm-1處有四面體非對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，以及500～650 cm-1處有彎曲振動(dòng)峰[12]。這些吸收振動(dòng)峰的存在說明本研究得到的白色粉末確實(shí)為HAp。圖6B為絲素蛋白基底上利用電化學(xué)沉積所得白色沉積粉末的XRD圖譜。該圖譜顯示了 HAp 在（100）、（002）、（210）、（211）、（130）、（222）、（213）和（304）這些晶面的特征衍射峰，但總體上XRD衍射峰較寬。結(jié)合以往的研究[13-14]，說明這些沉積的白色粉末為結(jié)晶不完全的HAp。

表1 SF膜表面沉積HAp的元素含量Table1 Element of HAp deposited on SFfilm surface

圖6 SF膜表面沉積HAp的FTIR圖譜（A）和XRD圖譜（B）Fig.6 FTIR(A)and XRD(B)spectraof HAp deposited on SFfilm surface

3 結(jié)論

本研究以SF膜為基底，結(jié)合電化學(xué)方法于常溫下成功制備了納米HAp涂層，詳細(xì)探討了各試驗(yàn)參數(shù)（電流密度、沉積時(shí)間和電解液pH）對(duì)沉積HAp形貌的影響。當(dāng)電解液pH為5.3、電流密度為2.5 mA/cm2、沉積時(shí)間為30 min時(shí)，可以得到孔隙尺寸均一、整體形貌平整的沉積涂層，其結(jié)晶型也與天然骨組織中的納米HAp結(jié)晶型類似。本研究揭示了利用電化學(xué)方法在SF膜表面沉積HAp的規(guī)律，為制備不同結(jié)構(gòu)和功能的HAp/SF復(fù)合材料提供了設(shè)計(jì)思路和理論參考。

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