氣相色譜法測定金銀花露中芳樟醇含量

馬 力,張楓源,向 福,2*,丁蘭草,吳 慧,何 峰,2

(1.經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃岡 438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北 黃岡 438000)

金銀花(Lonicera japonica),也稱忍冬,藥食兩用的名貴中藥材,用藥歷史悠久,具有清熱解毒、疏風(fēng)散熱、活血化瘀之功效［1-3］,其綠原酸、木犀草素、芳樟醇等藥用成分對多種疾病有良好的預(yù)防和治療效果［2,4］,是養(yǎng)生保健佳品,廣泛用于食品行業(yè)［5］。大別山地區(qū)金銀花資源豐富,“羅田金銀花”香氣濃郁、揮發(fā)油含量高,2011年獲批中國地理標(biāo)志產(chǎn)品,推動了地方以金銀花露加工為代表的金銀花產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

金銀花露是一種傳統(tǒng)的消暑解熱飲品［6］,由金銀花用水蒸氣蒸餾提取其揮發(fā)性成分制得,為無色至淡黃色的透明液體,味微甜,氣芳香,清熱解毒、散熱疏風(fēng)［1,7］。芳樟醇是天然揮發(fā)油中分布最重要和最廣泛的萜烯香料之一,有百合花或鈴蘭花香,是金銀花發(fā)揮藥理作用的主要揮發(fā)性成分［6,8-9］,不僅抗菌活性明顯［10-12］,同時(shí)具有抗炎、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠等保健醫(yī)療作用［13-16］,因此中國藥典2015版將其作為金銀花露產(chǎn)品質(zhì)量規(guī)范控制的指標(biāo)性成分,但并無其含量測定項(xiàng)［7,17］。

目前大別山地區(qū)金銀花露產(chǎn)品較多,但質(zhì)量參差不齊,產(chǎn)品中芳樟醇含量等指標(biāo)有待進(jìn)一步規(guī)范。近年來,金銀花露產(chǎn)品質(zhì)量逐漸引起人們關(guān)注,但產(chǎn)品中芳樟醇含量的報(bào)道僅限于兩家企業(yè)的3批金銀花露樣品和一種自制山銀花露樣品［17-18］,缺乏代表性。因此,本研究根據(jù)中國藥典2015版建立了測定芳樟醇含量的氣相色譜法,并利用該方法測定了5個(gè)廠家市售不同批次的24種金銀花露產(chǎn)品中芳樟醇含量,旨在為金銀花露產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅田金銀花干花原料：由湖北楚天舒藥業(yè)有限公司提供；乙酸乙酯、正辛醇(均為分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；芳樟醇對照品(CAS：78-70-6)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；A和B兩家企業(yè)的金銀花露不同批次樣品購于當(dāng)?shù)厮幍旰统?C、D、E三家企業(yè)的金銀花露不同批次樣品由企業(yè)提供,共52個(gè)樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent GC7890A氣相色譜儀配火焰離子化檢測器(flame ionization detector,FID)：美國安捷倫科技公司；FA2104電子分析天平：上海精細(xì)天平有限公司；DZTW調(diào)溫電熱套：北京市永光明醫(yī)藥儀器有限公司；玻璃標(biāo)準(zhǔn)口油水分離器：科學(xué)教研玻璃儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品溶液制備

(1)內(nèi)標(biāo)物溶液的配制

精密量取0.5mL正辛醇至50mL容量瓶,用乙酸乙酯定容混勻后,取出1 mL溶液置于100 mL容量瓶,用乙酸乙酯定容,混勻,制得質(zhì)量濃度83.0μg/mL的內(nèi)標(biāo)物溶液,備用。

(2)芳樟醇對照液的配制

精密量取0.6mL芳樟醇于25mL容量瓶,用乙酸乙酯定容混勻后,取出1 mL于100 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,混勻,制得質(zhì)量濃度202.51μg/mL的芳樟醇溶液,取該溶液1 mL于10 mL容量瓶,乙酸乙酯定容,搖勻制得質(zhì)量濃度為20.3μg/mL的芳樟醇對照液,備用。

(3)金銀花露及金銀花供試液的制備

按照《中國藥典》2015年版的鑒別方法［7］,取金銀花露飲料100 mL,置于圓底燒瓶,加氯化鈉20 g和適量沸石,連接油水分離器,自分離器上端加水至刻度部分,并溢流入燒瓶為止,再加入乙酸乙酯2～5 mL,電熱套加熱至沸騰,保持微沸2 h,放冷后吸出乙酸乙酯層,并加入適量無水硫酸鈉脫水,靜置分層后,吸取上清液置于10 mL容量瓶,加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)物(正辛醇)溶液,乙酸乙酯定容,搖勻即為金銀花露供試液,備用。

稱取干金銀花樣品10g置于圓底燒瓶,加氯化鈉20g,連接油水分離器,按上述操作,脫水后吸取上清液置于10mL容量瓶,加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)物(正辛醇)溶液,乙酸乙酯定容,搖勻即為金銀花供試液,備用。

1.3.2 氣相色譜法檢測

對芳樟醇對照液和供試液采用氣相色譜分析,所得結(jié)果用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中芳樟醇的含量。氣相色譜條件：Agilent HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；程序升溫：初始溫度為70℃,保持1 min,以3℃/min的速率升溫至130℃,再以50℃/min的速率升溫到250℃,維持8 min；汽化室溫度：260 ℃；載氣：氮?dú)?N2),柱流速：3 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比為1∶1。

1.3.3 方法驗(yàn)證

(1)最小檢出限濃度試驗(yàn)

精密量取芳樟醇對照液0.02 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL,分別加入10 mL容量瓶,各精密加入內(nèi)標(biāo)物溶液0.5 mL,用乙酸乙酯稀釋定容,制得芳樟醇質(zhì)量濃度分別為0.04μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.41μg/mL的對照品溶液。按照1.3.2節(jié)條件進(jìn)行氣相色譜法分析,對比內(nèi)標(biāo)物正辛醇和芳樟醇的出峰情況和保留時(shí)間。

(2)線性關(guān)系試驗(yàn)

精密量取芳樟醇對照液0.05 mL、0.10 mL、1.00 mL、2.00 mL和5.00 mL,分別加入10 mL容量瓶,各精密量加入內(nèi)標(biāo)物溶液0.50 mL,用乙酸乙酯稀釋定容,制備系列濃度的對照品溶液。按照1.3.2節(jié)條件進(jìn)行氣相色譜法分析,記錄峰面積。

(3)精密度試驗(yàn)

取芳樟醇対照液5.0 mL,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)物溶液,用乙酸乙酯稀釋定容。按照1.3.2節(jié)條件進(jìn)行氣相色譜法分析,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄內(nèi)標(biāo)物和芳樟醇峰面積。

(4)重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取芳樟醇対照液1.5 mL,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)物溶液,用乙酸乙酯稀釋定容,平行制備7份。按照1.3.2節(jié)條件進(jìn)行氣相色譜法分析,記錄內(nèi)標(biāo)物和芳樟醇峰面積。

(5)穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取2 mL芳樟醇對照液,置于10 mL容量瓶,精密加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)物溶液,用乙酸乙酯稀釋定容,分別在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h時(shí)間區(qū)段按照1.3.2節(jié)條件進(jìn)行氣相色譜法分析,記錄內(nèi)標(biāo)物和芳樟醇峰面積。

(6)加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知芳樟醇質(zhì)量濃度(17.64μg/100mL)的金銀花露飲料樣品100mL,加入1mL芳樟醇對照液(20.3μg/mL),混勻,平行制備7份。按照1.3.1節(jié)方法提取制備供試液,并按1.3.2節(jié)條件進(jìn)行氣相色譜法分析,記錄內(nèi)標(biāo)物和芳樟醇峰面積,計(jì)算加樣回收率。

1.3.4 樣品芳樟醇含量測定

取不同批次的52個(gè)金銀花露樣品(樣品制備3個(gè)平行樣,少數(shù)產(chǎn)品由于樣品量不足,制備2個(gè)平行樣或無平行樣)和干金銀花樣品,按照1.3.1節(jié)方法提取制備供試液,并按1.3.2節(jié)條件進(jìn)行氣相色譜法分析,記錄內(nèi)標(biāo)物和芳樟醇峰面積,根據(jù)線性回歸方程計(jì)算樣品的芳樟醇含量。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用EXCEL 2003和SPSS22等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1 最小檢出限濃度

根據(jù)圖1所示氣相色譜圖,芳樟醇質(zhì)量濃度為0.04μg/mL時(shí),內(nèi)標(biāo)物正辛醇獨(dú)立出峰,保留時(shí)間為5.423 min,對照品芳樟醇無信號；質(zhì)量濃度0.10μg/mL時(shí),內(nèi)標(biāo)物和對照品均獨(dú)立出峰,且正辛醇和芳樟醇保留時(shí)間分別為5.422 min和6.175 min,分離度大于2。因此,本試驗(yàn)中芳樟醇最小檢出限為0.10μg/mL。

圖1 不同質(zhì)量濃度芳樟醇的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of linalool with different concentration

2.1.2 線性關(guān)系

確定線性關(guān)系的最低濃度不低于最小檢出限,并以對照品芳樟醇與內(nèi)標(biāo)物正辛醇的質(zhì)量濃度比(x)為橫坐標(biāo),峰面積比(y)為縱坐標(biāo),擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2),得線性回歸方程為y=0.7004x-0.0089,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4,表明芳樟醇含量在0.1013～10.125 0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 芳樟醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of linalool

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)

同一質(zhì)量濃度的芳樟醇對照液重復(fù)進(jìn)樣6次,測定芳樟醇峰面積和內(nèi)標(biāo)物正辛醇的峰面積,結(jié)果如表1所示。由表1可知,芳樟醇與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為1.05%,表明該方法儀器的精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision tests

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

平行制備同一濃度的芳樟醇對照液7份,測定芳樟醇峰面積和內(nèi)標(biāo)物正辛醇的峰面積,結(jié)果如表2所示。由表2可知,芳樟醇與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的RSD為0.65%＜2.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of repeatability tests

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試液配制后不同時(shí)間進(jìn)樣,測試穩(wěn)定性,結(jié)果如表3所示。由表3可知,芳樟醇與內(nèi)標(biāo)物正辛醇的峰面積比值RSD=1.20%＜2.00%,表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定,表明該方法穩(wěn)定性良好。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of stability tests

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn)

平行制備已知芳樟醇質(zhì)量濃度(17.64μg/100 mL)的金銀花露樣品7份,精密加入1mL芳樟醇對照液(20.3μg/mL),加樣回收率計(jì)算結(jié)果如表4所示。由表4可知,芳樟醇的平均回收率為100.27%(n=7),RSD為1.62%＜2.0%,表明本試驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=7)Table 4 Results of adding sample recovery rate test

2.3 樣品芳樟醇含量測定

內(nèi)標(biāo)法計(jì)算24種金銀花露產(chǎn)品共52個(gè)批號樣品中芳樟醇含量結(jié)果見表5。由表5可知,A、B、C三家生產(chǎn)企業(yè)的16種產(chǎn)品共35個(gè)樣品均檢測到芳樟醇,D、E兩家生產(chǎn)企業(yè)的8種產(chǎn)品共17個(gè)批號樣品未檢出芳樟醇信號,其芳樟醇含量可能低于本方法的最小檢出限為0.10μg/mL。

檢測出芳樟醇信號的16種金銀花露產(chǎn)品含量比較如圖3所示。由表5和圖3可知,芳樟醇含量最高和最低的產(chǎn)品均來自A企業(yè),A1產(chǎn)品芳樟醇含量最低,為(12.30±0.72)μg/100mL,A2(國藥準(zhǔn)字)產(chǎn)品芳樟醇含量最高,達(dá)到(31.47±4.52)μg/100 mL,且與其他產(chǎn)品含量均有顯著差異(P＜0.05)；其次是C企業(yè)的C7和C10兩種產(chǎn)品芳樟醇含量較高,分別為(22.75±1.66)μg/100 mL和(22.12±2.26)μg/100 mL,且與其他產(chǎn)品含量差異顯著(P＜0.05)；C企業(yè)8種產(chǎn)品和B企業(yè)4種產(chǎn)品的芳樟醇含量基本平穩(wěn),在14.90～18.62μg/100 mL之間。從生產(chǎn)企業(yè)自身看,A企業(yè)的兩種金銀花露產(chǎn)品芳樟醇含量差異極其明顯,反映了兩種產(chǎn)品作為藥品和食品飲料的不同定位,但在質(zhì)量控制上,兩個(gè)批號的A1產(chǎn)品芳樟醇含量穩(wěn)定,三個(gè)批號A2產(chǎn)品中一個(gè)批號的芳樟醇含量差異顯著(P＜0.05)；B企業(yè)的B4產(chǎn)品也出現(xiàn)一個(gè)批號的芳樟醇含量差異顯著(P＜0.05)；C企業(yè)的10種產(chǎn)品中,C6、C7、C8三種產(chǎn)品的不同批號均存在芳樟醇含量的顯著差異(P＜0.05),其他7種產(chǎn)品不同批次間的芳樟醇含量則無差異(P＞0.05),質(zhì)量穩(wěn)定。根據(jù)表5和圖3,所檢測的52個(gè)批號樣品中,芳樟醇含量在12.30～31.47μg/100 mL范圍變動,部分企業(yè)的產(chǎn)品甚至未檢測到芳樟醇信號,且同一產(chǎn)品的不同批次間芳樟醇含量指標(biāo)也存在顯著性差異(P＜0.05)。

表5 金銀花露樣品中芳樟醇含量測定結(jié)果(n=3)Table 5 Determination results of linalool contents of L.japonica distillate samples

圖3 16種金銀花露樣品的芳樟醇含量對比Fig.3 Comparison of linalool contents among 16 kinds of L.japonica distillate samples

2.4 討論

為深入比較金銀花原料與金銀花露產(chǎn)品中芳樟醇含量,從本地企業(yè)實(shí)地取樣,測的羅田金銀花干花中芳樟醇含量為(22.12±1.45)μg/g,該結(jié)果雖較萬琴等［19］測定的河南、山東、江蘇等產(chǎn)地金銀花藥材中芳樟醇含量低,但與何俊婷等［9］測定的山東平邑金銀花芳樟醇含量相當(dāng)。按大別山的羅田金銀花1 g干花加工成100 mL金銀花露折算(金銀花原料成本低至0.1元/100 mL),該類產(chǎn)品芳樟醇含量應(yīng)該≥22.12μg/100 mL,達(dá)到該指標(biāo)值的只有A2、C7和C10三種金銀花露產(chǎn)品。

3 結(jié)論

以正辛醇為內(nèi)標(biāo)物,建立了金銀花露中芳樟醇含量指標(biāo)測定的氣相色譜法。該方法簡便、準(zhǔn)確、可靠,芳樟醇最小檢出限為0.10μg/mL。利用該方法檢測了大別山地區(qū)24種金銀花露產(chǎn)品的52個(gè)批號樣品,8種產(chǎn)品未檢出芳樟醇信號,16種產(chǎn)品的芳樟醇含量在12.30～31.47μg/100 mL范圍變化,僅3種產(chǎn)品100 mL劑量達(dá)到羅田金銀花1 g干花的芳樟醇含量,且部分批次產(chǎn)品間芳樟醇含量差異顯著(P＜0.05),質(zhì)量不穩(wěn)定。測定結(jié)果說明金銀花露產(chǎn)品質(zhì)量有待進(jìn)一步規(guī)范和完善,并能以芳樟醇含量作為其質(zhì)量控制的指標(biāo),從而為金銀花露的質(zhì)量控制提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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