不同釀酒高粱酚類物質(zhì)含量測定及抗氧化活性比較

田新惠,唐玉明,任道群,姚萬春,劉茂柯,張星宇

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻高粱研究所生物中心,四川 德陽 618000；2.瀘州市釀酒科學(xué)研究所,四川 瀘州 646100)

高粱是世界五大作物之一［1］,在我國種植面積廣泛,主要用于釀酒、釀醋以及工業(yè)原料等［2］。高粱是白酒的主要釀造原料,俗話說“好酒離不開紅糧”說明原料對(duì)白酒品質(zhì)的重要性［3］。高粱籽粒中富含多酚類化合物、原花青素、黃酮類化合物、單寧酸等具有很強(qiáng)的抗氧化成分［4］。有研究發(fā)現(xiàn),富含多酚的高粱品種釀造的白酒口感綿甜,回味悠長,是優(yōu)質(zhì)白酒釀造原料［5-6］。

高粱籽粒中多酚類物質(zhì)豐富,其含量在不同地區(qū)與品種間的差異較大［7-8］。優(yōu)質(zhì)白酒多選用四川糯紅高粱,結(jié)合特殊的釀造工藝進(jìn)行釀造而成。目前從白酒中已檢測出多種對(duì)人體有益的功能性成分［9］,包括低分子有機(jī)酸、酯類、雜環(huán)類等多酚類物質(zhì)成分,如阿魏酸等具有健康保健功效［10］。釀造原料中的酚酸類物質(zhì)也是白酒中風(fēng)味物質(zhì)形成的前體物質(zhì)。

目前,對(duì)于釀酒高粱的研究,僅限于優(yōu)良品種的培育,而對(duì)釀酒高粱籽粒中多酚類化合物的研究較少。因此,本實(shí)驗(yàn)從釀造原料“紅糧”入手,以企業(yè)推廣應(yīng)用的釀酒高粱為研究對(duì)象,研究不同品種釀酒高粱籽粒中游離態(tài)與結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的組成及含量,并進(jìn)行抗氧化活性分析,為篩選優(yōu)質(zhì)專用釀造品種提供理論支持,以期為優(yōu)化釀造工藝以及健康白酒有益成分來源的形成提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用釀酒高粱品種見表1,2016年收獲成熟新籽粒,曬干,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

沒食子酸(純度≥97.9%)、原兒茶酸(純度≥98.9%)、龍膽酸(純度≥99.5%)、咖啡酸(純度≥99.0%)、香草酸(純度≥98.2%)、丁香酸(純度≥98.0%)、香豆酸(純度≥98.0%)、阿魏酸(純度≥99.3%)、水溶性維生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid,Trolox)(純度≥98.0%)、三吡啶三吖嗪(tripyridyl-triazine,TPTZ)(純度≥98.0%)、福林酚(色譜純)：美國Sigma公司；蘆丁(純度≥98%)：索萊寶生物有限公司；無水甲醇、碳酸鈉、亞硝酸、過硫酸鉀、六水氯化鋁、乙酸乙酯(均為分析純)：恒泰力天生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮科技有限公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀：德國賽默飛公司；U-3010型紫外可見分光光度計(jì)：日本Hitachi公司；CT410旋風(fēng)式樣品磨：福斯賽諾分析儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮系列儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒高粱籽粒樣品的制備

分別稱取100 g不同品種的高粱籽粒,粉碎,過80目篩后,于-20℃保存。

1.3.2 釀酒高粱籽粒中水分含量的測定［11］

采用差減法測定水分含量,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 釀酒高粱籽粒中游離態(tài)酚類物質(zhì)的提取

參照TIH等［12］的方法稍有改動(dòng)：稱取釀酒高粱籽粒樣品1 g,加入15 mL溫度為4℃的酸化甲醇(體積分?jǐn)?shù)95%甲醇∶1 mol/LHCl=85∶15,V/V)于4℃條件下振蕩提取10 min,3 500×g離心10 min,取上清液,重復(fù)提取3次后,合并上清液,于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無水狀態(tài),用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶解并定容至10 mL,于-20℃保存,待測。

1.3.4 釀酒高粱籽粒中結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的提取

參照SHENGER等［13］的方法提取高粱籽粒中結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)：向提取游離酚后的沉淀物中,加入20 mL 2 mol/L NaOH,在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌1 h后,用HCl(6 mol/L)調(diào)節(jié)水解液的pH值至1.5～2.0,添加80 mL正己烷振蕩除脂類物質(zhì),加入40 mL乙酸乙酯,靜置15 min,3 000×g離心15 min,重復(fù)提取5次后,合并提取液,于45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,采用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶解并定容至10 mL,于-20℃保存。

1.3.5 釀酒高粱籽粒中總酚含量的測定［14］

樣品中總酚含量的測定：以沒食子酸(gallic acid,GA)標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程：y=23.54x+0.043,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3。按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總酚的含量,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent,GAE)表示mg GAE/100 g。

1.3.6 釀酒高粱籽粒中總黃酮含量的測定［15］

樣品中總黃酮含量的測定：以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程：y=0.003 1x+0.004 4,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮的含量,結(jié)果以mg/100 g表示。

1.3.7 高效液相色譜法測定酚酸物質(zhì)的含量［16］

采用高效液相色譜(highperformanceliquid chromatography,HPLC)法測定釀酒高粱籽粒中單體酚酸物質(zhì)的含量,HPLC檢測條件：SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；檢測波長280 nm；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為10μL；流動(dòng)相A(2%甲酸)和流動(dòng)相B(乙腈),梯度洗脫條件：0～30 min,A 95%～75%,B 5%～25%；30～50min,A 60%,B 40%；50～60 min,A 95%,B 5%,后運(yùn)行5 min,總運(yùn)行時(shí)間65 min；流速為0.80 mL/min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)品(沒食子酸、原兒茶酸、龍膽酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸)系列溶液,按照高效液相色譜法測定并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線,每種酚類化合物的含量測定結(jié)果用μg/g表示。

1.3.8 抗氧化活性分析［17-18］

(1)釀酒高粱籽粒樣品鐵離子還原力測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)稍作相應(yīng)修改：制備鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidantpower,FRAP)試劑,取20μL高粱籽粒游離酚、結(jié)合酚提取液,加入260μL FRAP試劑,充分混勻避光反應(yīng)20 min,然后在波長593 nm處測定吸光度值。以不同濃度(x)Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液為橫坐標(biāo),吸光度值(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程：y=0.002 0x-0.036 1,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8,按照Trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計(jì)算樣品的FRAP值,結(jié)果以μmol/g表示。

(2)釀酒高粱籽粒樣品自由基清除能力測定［18］

2,2‘-連氮-二(3乙基苯并咪唑啉-6磺酸)(2,2‘-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid,ABTS)自由基清除能力測定：用無水甲醇調(diào)節(jié)ABTS母液的濃度,使其在波長734 nm處的吸光度值為0.70±0.02,將其作為ABTS自由基工作液。4.9mL ABTS自由基工作液與0.1mL高粱籽粒提取液混合,靜置,室溫條件下反應(yīng)10 min后立即在波長734 nm處測定吸光度值,以無水甲醇作空白,按照Trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,計(jì)算樣品的ABTS自由基清除能力,采用Trolox當(dāng)量(Trolox equivalent,TE)表示某種抗氧化劑相當(dāng)于Trolox的濃度(mmol/L),結(jié)果以μmol TE/g表示。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0、Excel2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,重復(fù)3次,數(shù)值以均值加標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種釀酒高粱籽粒的總酚含量

不同品種釀酒高粱籽粒中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)總酚含量測定結(jié)果見圖1。由圖1可知,不同品種釀酒高粱籽粒結(jié)合態(tài)總酚存在顯著性差異(P＜0.05),其中,國窖紅高粱籽粒結(jié)合態(tài)總酚含量最高為1 383.08 mg GAE/100 g,內(nèi)蒙高粱總酚含量最低為618.2 mg GAE/100 g。而游離態(tài)總酚含量之間差異較小,其中,瀘糯8號(hào)來源的高粱籽粒含量最高為274.38 mg GAE/100 g。結(jié)合態(tài)總酚含量高于游離態(tài)總酚含量,表明釀酒高粱籽粒中總酚以結(jié)合態(tài)為主。

圖1 不同品種釀酒高粱籽粒中總酚含量測定結(jié)果Fig.1 Determination results of total phenolic contents in different varieties of liquor-making sorghum

2.2 不同釀酒高粱品種的總黃酮含量

不同品種釀酒高粱籽粒游離態(tài)和結(jié)合態(tài)總黃酮含量測定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,不同品種釀酒高粱籽粒中的結(jié)合態(tài)總黃酮含量均高于游離態(tài)總黃酮含量。青殼洋、國窖紅、瀘糯8號(hào)高粱品種的結(jié)合態(tài)總黃酮含量(434.84mg/100g、303.39mg/100g、267.58mg/100g)明顯高于遼寧、山西、內(nèi)蒙高粱品種(123.06mg/100g、162.90mg/100g、175.48mg/100g),且結(jié)合態(tài)黃酮含量品種間差異顯著(P＜0.05)。不同品種釀酒高粱籽粒間的游離態(tài)黃酮含量差異較小,表明釀酒高粱籽粒中的黃酮類物質(zhì)主要以結(jié)合態(tài)形式存在。

圖2 不同品種釀酒高粱籽粒中總黃酮含量測定結(jié)果Fig.2 Determination results of total flavonoids contents in different varieties of liquor-making sorghum

2.3 不同釀酒高粱籽粒中酚酸物質(zhì)含量

采用高效液相色譜法測定不同釀酒高粱籽粒中游離型與結(jié)合型酚酸物質(zhì)含量。7種混合標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖如圖3所示。由于龍膽酸檢測波長為320 nm,故而未在混標(biāo)之內(nèi),采用單標(biāo)測定。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)混合標(biāo)樣HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed standard sample

不同品種釀酒高粱籽粒中游離態(tài)與結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)組成及含量測定結(jié)果見表2。由表2可知,不同品種釀酒高粱籽粒中的游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)組成基本相同,但品種間各酚酸物質(zhì)含量差異顯著(P＜0.05)。釀酒高粱籽粒中香豆酸、咖啡酸、香草酸、原兒茶酸、丁香酸、阿魏酸均以游離態(tài)與結(jié)合態(tài)形式存在,而沒食子酸僅以游離態(tài)形式存在,龍膽酸在檢測樣品中均未檢出。釀酒高粱籽粒中游離態(tài)酚酸主要以阿魏酸、丁香酸與沒食子酸為主,三者約分別占游離態(tài)總酚酸的39.6%、24.6%及23.3%,平均含量分別為611.19μg/g、380.66μg/g、359.34μg/g。結(jié)合態(tài)酚酸含量主要以阿魏酸、丁香酸為主,其含量分別占結(jié)合態(tài)總酚酸的72.69%、17.03%,平均含量分別為1 608.33μg/g、376.78μg/g。

表2 不同品種釀酒高粱籽粒中酚酸物質(zhì)含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of phenolic acids contents in different varieties of liquor-making sorghum μg/g

2.4 不同品種釀酒高粱籽粒的鐵離子還原能力

不同品種釀酒高粱籽粒的游離態(tài)與結(jié)合態(tài)物質(zhì)的鐵離子還原能力如表3所示。由表3可知,釀酒高粱籽粒中游離態(tài)鐵離子還原能力值在5.92～7.46μmol/g范圍內(nèi)。結(jié)合態(tài)抗氧化能力值在29.37～55.34μmol/g范圍內(nèi),且結(jié)合態(tài)多酚的抗氧化能力為游離態(tài)的抗氧化能力的5～8倍,其中結(jié)合態(tài)抗氧化能力占總抗氧化能力的85.7%。6種釀酒高粱品種的總抗氧化能力順序依次為瀘糯8號(hào)＞青殼洋＞國窖紅＞內(nèi)蒙高粱＞山西高粱＞遼寧高粱,四川釀酒高粱籽粒中總抗氧化能力高于其他地區(qū)釀酒高粱籽粒。

表3 不同釀酒高粱品種的FRAP值Table 3 FRAP value of different varieties of liquor-making sorghum

2.5 不同品種釀酒高粱籽粒的ABTS自由基清除能力

不同品種釀酒高粱籽粒的游離態(tài)與結(jié)合態(tài)物質(zhì)的ABTS自由基清除能力如表4所示。由表4可知,釀酒高粱籽粒中游離態(tài)ABTS自由基清除能力在5.49～7.43μmol TE/g范圍內(nèi)；結(jié)合態(tài)ABTS自由基清除能力在30.79～47.84μmol TE/g范圍內(nèi)。結(jié)合態(tài)為游離態(tài)ABTS自由基清除能力的6倍,品種間差異顯著(P＜0.05)。釀酒高粱籽粒結(jié)合態(tài)ABTS自由基清除能力占總ABTS自由基清除能力的85.4%。6種釀酒高粱品種ABTS自由基清除能力順序依次為瀘糯8號(hào)＞青殼洋＞國窖紅＞內(nèi)蒙高粱＞山西高粱＞遼寧高粱,且四川釀酒高粱籽粒中抗氧化能力高于其他地區(qū)釀酒高粱品種。

表4 不同釀酒高粱品種的ABTS自由基清除Table 4 ABTS free radical scavenging of different varieties of liquor-making sorghum

3 結(jié)論

(1)六種釀酒高粱籽粒中總酚、總黃酮以及8種酚酸總和的含量范圍分別為799.45～1630.58 mg/100 g,228.30～583.15 mg/100 g,238.9～492.6 mg/100 g,即總酚含量＞總酚酸含量＞總黃酮含量。高粱糠中總酚含量為1 127.49 mg GAE/100 g［19］,這與釀酒高粱籽粒中總酚含量相接近,表明高粱籽粒中多酚物質(zhì)集中于表皮［20］。與其他谷物相比,釀酒高粱籽粒中總酚、總黃酮含量高約為糙米總酚的5～8倍,糙米黃酮的4倍左右［21］。

(2)抗氧化活性檢測方法基于以下機(jī)理：在特定條件下,檢測體系中自由基的清除能力與樣品的還原能力反映被測物的抗氧化活性。FRAP鐵離子還原能力,樣品的還原力越強(qiáng),抗氧化能力越強(qiáng)。ABTS抗氧化能力,由過硫酸銨氧化作用產(chǎn)生的單陽離子自由基,可與任何羥基化的芳香族化合物反應(yīng),與實(shí)際抗氧化能力有關(guān)［22］,這兩種方法均能良好的反映高粱籽粒中抗氧化活性。通過測定釀酒高粱籽粒中游離型與結(jié)合型酚類化合物都具有較強(qiáng)抗氧化能力［23］。

(3)不同存在形態(tài)的酚類物質(zhì)對(duì)不同體系抗氧化作用存在差異,與酚類物質(zhì)相對(duì)含量、存在形態(tài)以及鍵合方式有關(guān)［24］。本研究中釀酒高粱籽粒中,結(jié)合酚類物質(zhì)的抗氧化活性占總抗氧化活性85%以上,這與結(jié)合型酚類物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于游離型酚類物質(zhì)含量成正相關(guān)。結(jié)合型酚類物質(zhì)如何影響其抗氧化能力還需進(jìn)一步的研究。鑒于釀酒高粱籽粒中含有豐富的多酚類物質(zhì)與良好的抗氧化活性,可進(jìn)一步研究發(fā)酵過程中多酚等小分子物質(zhì)變化對(duì)發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)形成的作用［25］。

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