氣質(zhì)聯(lián)用內(nèi)標法測定飲料酒中氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯

徐躍成,王 健,艾濤波,羅 玥,劉茂坪,明紅梅

(1.四川省食品藥品檢驗檢測院,四川 成都 610100；2.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院,四川 自貢 643000)

氨基甲酸甲酯(methyl carbamate,MC)、氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)是發(fā)酵工藝生產(chǎn)食品時的副產(chǎn)物［1］,如酒類的生產(chǎn)工藝過程中就會產(chǎn)生一定量的EC和MC。2007年國際癌癥研究機構(gòu)將EC定為2A類致癌物［2-3］,長期飲酒者是EC受害的高危人群［4-5］；MC也是一種致癌物質(zhì),可能誘發(fā)良性或惡性腫瘤,特別是肺癌與肝癌［6］。據(jù)文獻報道,酒精性飲料中含有MC和EC的比例很高；國外已有報道在一些酒精性飲料中檢出了MC和EC,許多國家都已有酒精性飲料中MC和EC相關(guān)的一些限量標準［7-8］。然而我國迄今只制定了一些單一檢測食品產(chǎn)品中EC的方法標準,如出口酒中的EC檢測方法標準,飲料酒中EC的測定地方標準以及2014年制定的食品中EC的測定國家標準［9-11］,并未制定酒類產(chǎn)品中MC的檢測方法標準,也尚未在酒類產(chǎn)品中制定EC和MC的限量標準來規(guī)范企業(yè)生產(chǎn),以降低食品安全系統(tǒng)風(fēng)險和保護消費者權(quán)益［12］。鑒于酒類產(chǎn)品在國內(nèi)有巨大的社會消費量以及可能由MC和EC帶來的食品安全風(fēng)險不容忽視,有必要建立有效的方法對其中的MC和EC含量進行同時測定,為制定酒類產(chǎn)品中MC和EC的同時測定方法標準提供方法參考,也可利用建立的方法分析MC和EC在酒類產(chǎn)品生產(chǎn)工藝過程中的產(chǎn)生途徑,從源頭降低MC和EC的引入風(fēng)險。文獻報道表明,使用氨基甲酸乙酯專用固相萃取柱和同位素內(nèi)標法測定白酒中氨基甲酸乙酯能有較好的穩(wěn)定性和回收率［13］,因此在此基礎(chǔ)上建立同時測定酒精性飲料中MC、EC含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氯甲烷、乙腈(色譜純)：美國Sigma公司；無水硫酸鈉(分析純)：成都市科龍化工試劑廠；氨基甲酸甲酯(純度99.93%)：北京百靈威科技有限公司；氨基甲酸乙酯(純度99.7%)：美國AccuStandard公司；d5-氨基甲酸乙酯(純度99.6%)：加拿大CDN ISOTOPES公司；氨基甲酸乙酯固相萃取專用小柱(Cleanert EC-SPE 4 g/25mL)：美國Agela公司；白酒酒樣：四川地區(qū)白酒企業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)抽樣及市售；發(fā)酵果酒酒樣：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Varian(CP-3800)-320MS/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀(gaschromatography-massspectrometry,GC-MS)：美國瓦里安技術(shù)(中國)有限公司；Laborota4000旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)器：德國heidolph海道夫公司；Dragon LabMX-S漩渦混合器：深圳良誼公司；FA2004N分析天平(感量0.000 1 g)：上海菁華公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

內(nèi)標及標準儲備液：確稱取氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯及d5-氨基甲酸乙酯各0.050 g溶于50 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,該溶液每1 mL相當于1 mg氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯及d5-氨基甲酸乙酯。

內(nèi)標使用液：取d5-氨基甲酸乙酯標準儲備溶液用乙腈稀釋至d5-氨基甲酸乙酯含量為1 mg/L。

氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯標準使用液：取適量的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯標準溶液,用乙腈分別稀釋至氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯含量為10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜操作條件

色譜柱：VF-Wax MS(30 m×0.25 mm×0.25μm)；柱溫：60℃保持1 min,以5℃/min升至120℃,再以10℃/min升至240℃,保持2 min；進樣口：220℃,不分流進樣；接口溫度：240℃；離子源溫度：230℃；電子電離源(electronionization,EI)電壓：70 eV；溶劑延遲時間：13 min；進樣體積：1 μL；定性離子分別為EC(m/z)：62,74,89；MC(m/z)：55,59,75；d5-EC(m/z)：64,76；定量離子分別為EC(m/z)：62；MC(m/z)：75；d5-EC(m/z)：64。1.3.3樣品處理方法

稱取適量酒類樣品于50 mL離心管中,加入d5-氨基甲酸乙酯內(nèi)標溶液0.4 mL,用振蕩器混勻,將離心管內(nèi)樣品轉(zhuǎn)至氨基甲酸乙酯固相萃取專用小柱,飽和10 min,繼續(xù)加入2×15 mL二氯甲烷洗脫入雞心瓶,收集二氯甲烷液,45℃水浴減壓濃縮至近干,冰水浴放置冷卻,然后用2 mL乙腈溶解殘渣,并加入2 g無水硫酸鈉脫水,經(jīng)濾膜過濾后,待上機測定。

1.3.4 樣品定性與定量

定性方法：質(zhì)譜儀進行測定,在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中,所選擇的離子全部出現(xiàn),同時所選擇的離子豐度比與標準品相關(guān)離子的相對豐度一致,且波動范圍在容許偏差之內(nèi)。

定量方法：采用內(nèi)標法定量,進樣1μL標準系列中各濃度標準使用液于氣質(zhì)聯(lián)用儀中,測定不同濃度氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯及d5-氨基甲酸乙酯的峰面積。以濃度為橫坐標,測定峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線。同時進樣1μL試樣溶液,測定峰面積與內(nèi)標峰面積的比值與標準曲線比較定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線和方法檢出限

圖1 MC、d5-EC、EC標準品總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of MC,D5-EC and EC standards

圖2 MC(A)、d5-EC(B)、EC(C)的定性質(zhì)譜圖Fig.2 Qualitative mass spectrum of MC(A),d5-EC(B)and EC(C)

使用內(nèi)標法定性及定量,以質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(X),MC、EC與d5-EC的峰面積相對比值為縱坐標(Y),得到的線性方程在10～400μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,EC的線性方程為Y=0.003 9X-0.075,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4；MC的線性方程為Y=0.0013X-0.0227,相關(guān)系數(shù)R2=0.9961。相同色譜條件下,參照SN/T 0285—2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法氣相色譜-質(zhì)譜法》的EC檢出最低限值,以4 mL的50%vol白酒陰性樣為加標樣進行檢出限考察(n=6),MC和EC加標量均為0.04μg/4 mL,按1.3.3對其進行前處理并上機測定,得到本方法的檢出低限：MC、EC均為10μg/L(MC的相對標準偏差(relativestandard deviation,RSD)≤4.6%,EC的RSD≤0.9%),在檢出限濃度水平回收率良好,均為110%。

2.2 方法加標回收率及精密度

以50%vol白酒陰性樣(本底含量為0)為加標樣,取樣量4 mL,選取標準曲線中間點濃度對其進行添加回收試驗,MC的回收率加標量為0.4μg/4 mL(即100μg/L),EC的回收率加標量0.2μg/4 mL(即50μg/L),參照1.3.1對其進行前處理,結(jié)果見表1。MC和EC的精密度考察質(zhì)量濃度為200μg/L,分別平行測定6次,結(jié)果見表2。

表1 MC和EC加標回收率試驗結(jié)果(n=6)Table 1 Adding standard recovery rate tests results of MC and EC

由表1可知,該方法MC回收率為103%～108%,RSD=0.50%；EC回收率為96%～104%,RSD=3.79%；說明該方法準確度良好。

表2 MC和EC精密度試驗結(jié)果(n=6)Table 2 Precision tests results of MC and EC

由表2可知,該方法MC含量測定結(jié)果RSD=3.0%,EC含量測定結(jié)果RSD=2.0%,結(jié)果表明該方法精密度高。

2.3 酒精性飲料中MC和EC的檢出情況

2.3.1 白酒中的MC和EC的檢出情況

169個白酒抽檢樣品的EC檢出情況統(tǒng)計見表3。

表3 白酒中EC檢出情況統(tǒng)計(n=169)Table 3 Statistics of EC detection in Baijiu

由表3可知,EC未檢出4批次,占總比例2.4%,均為液態(tài)酒及液態(tài)勾兌白酒。結(jié)合樣品工藝和原料類型來看,總體檢測數(shù)據(jù)結(jié)果與國際、國內(nèi)文獻報道［4,8］的數(shù)據(jù)基本相符,也符合從其產(chǎn)生機理預(yù)期的檢測結(jié)果。

本實驗檢測全部批次白酒中的MC全部未檢出。其原因結(jié)合前述MC的產(chǎn)生機理及本項目抽取的白酒生產(chǎn)原料來看,應(yīng)該是所抽酒樣工藝過程中MC的前體物質(zhì)甲醇或氰化物［6］產(chǎn)生量很低,導(dǎo)致MC合成量低,因此產(chǎn)品中MC濃度很低。

2.3.2 發(fā)酵果酒的MC和EC檢出情況

表3 發(fā)酵果酒中MC和EC檢測結(jié)果Table 3 Detection results of MC and EC in fermented fruit wine μg/L

由發(fā)酵果酒EC、MC檢測結(jié)果(表4)可見,果酒中EC含量平均值為16μg/L；MC的檢出平均值為300μg/L,原因可能是該系列果酒發(fā)酵液中較白酒含有更高濃度的MC前體物質(zhì)利于MC的合成所致。

3 結(jié)論

采用固相萃取方式對酒精性飲料樣進行前處理,使用D5-氨基甲酸乙酯同位素內(nèi)標GCMS法同時測定其MC、EC含量,結(jié)果表明,在10～400μg/L范圍內(nèi),EC的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 6,MC的相關(guān)系數(shù)為0.996 1,二者檢出限均為10μg/L,MC加標回收率為103%～108%,RSD為0.50%；EC加標回收率為96%～104%,RSD為3.79%；方法準確性良好。MC含量測定結(jié)果RSD為3.0%,EC含量測定結(jié)果RSD為2.0%,方法精密度良好。抽樣檢驗結(jié)果表明,白酒中未檢出MC,其他酒精性飲料均含有一定量的MC和EC。

從本實驗檢測結(jié)果及相關(guān)文獻報道［4-7,9,12-13］可知,白酒及其他酒精性飲料中EC和MC均具有較高的檢出比例和較高的檢出含量,鑒于EC和MC復(fù)雜的形成機理和途徑［14-18］,建議相關(guān)監(jiān)管機構(gòu)完善白酒及其他酒精性飲料中EC、MC的風(fēng)險監(jiān)測體系,將尿素、氰化物、甲醇等前體物質(zhì)［19-21］與EC、MC含量一起納入風(fēng)險監(jiān)測,為廠家控制和減少EC、MC的引入提供方法建議,從本源上完善酒中EC、MC的風(fēng)險監(jiān)測體系,獲得更加確鑿的數(shù)據(jù)證據(jù),以確保酒類的生產(chǎn)、加工和儲存過程更加的規(guī)范而安全［22］,盡快的制定出我國相應(yīng)的限量標準。

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