稻米中無(wú)機(jī)離子鎘的HPLC-ICP-MS檢測(cè)技術(shù)研究

黃 徽,彭青枝*,周陶鴻

(1.湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,湖北 武漢 430075；2.湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心,湖北 武漢 430075)

鎘(cadmium)是一種重金屬元素,主要以與氧、氯、硫等無(wú)機(jī)元素形成化合物的形式廣泛分布于自然界中。鎘對(duì)生物體內(nèi)臟、腦、骨骼及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒害性,經(jīng)實(shí)驗(yàn)顯示,鎘對(duì)動(dòng)物的生殖和發(fā)育系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生影響,被美國(guó)毒物管理委員會(huì)列為第6位危及人體健康的有毒物質(zhì)［1-2］。鎘在環(huán)境中不能被生物降解,工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所造成的環(huán)境污染是生物體中鎘的主要來(lái)源。1950年代,日本富山縣神通川發(fā)生了著名的“痛痛病”事件［3］,探究日本“痛痛病”的因果關(guān)系后,環(huán)境中的鎘與健康的關(guān)系日益受到重視。鎘在正常環(huán)境中含量很低,但是易在生物體內(nèi)富集,具有高富集特性的作物如稻米等在正常環(huán)境中也能積累高濃度的鎘［4］,由于鎘易在生物體內(nèi)蓄積且難代謝,因此鎘成為影響食用安全的主要重金屬之一。近年來(lái),我國(guó)部分地區(qū)頻繁出現(xiàn)大米鎘超標(biāo)現(xiàn)象,超標(biāo)率約在5%～15%［5-7］,對(duì)人體健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅,社會(huì)各界對(duì)之高度關(guān)注并設(shè)法降低鎘大米的食用風(fēng)險(xiǎn)［8］。

鎘在生物體內(nèi)可以與蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等結(jié)合成有機(jī)鎘形態(tài),也可以以離子態(tài)存在。環(huán)境學(xué)和毒理學(xué)研究結(jié)果表明,離子態(tài)鎘(Cd2+)的毒性較高,結(jié)合態(tài)和有機(jī)態(tài)鎘無(wú)毒或毒性非常微弱［9］,通過(guò)食物攝入到人體中的重金屬代謝活性和毒害效應(yīng)與其存在形式有很大關(guān)系。林忠寧等［10］通過(guò)研究有機(jī)鎘染毒對(duì)小鼠免疫球蛋白及其亞類水平的影響,發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)鎘對(duì)體液免疫功能的抑制作用明顯高于有機(jī)鎘。若簡(jiǎn)單地采用鎘的總含量卻以其離子態(tài)的毒性效應(yīng)作為鎘毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可能會(huì)有失偏頗,往往會(huì)高估其毒害效應(yīng)。鎘的形態(tài)差異可以作為具有鎘富集特性的食品如稻米等安全性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵點(diǎn),目前關(guān)于稻米中鎘形態(tài)的研究較少。

稻米中的鎘在淀粉、脂肪等成分中含量很低,主要以與蛋白質(zhì)結(jié)合的形態(tài)存在,并且主要與谷氨酸(Glu)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)等氨基酸結(jié)合［11］。查燕等［12］通過(guò)葡聚糖凝膠層析法對(duì)稻米中鎘形態(tài)進(jìn)行分析也得出了相似結(jié)論。目前國(guó)標(biāo)GB 2762—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》中規(guī)定稻米中鎘限量為0.2 mg/kg,現(xiàn)行鎘的檢測(cè)方法是根據(jù)國(guó)標(biāo)GB 5009.15—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測(cè)定》中規(guī)定的方法,將大米中各種形態(tài)鎘消解轉(zhuǎn)化成離子態(tài)鎘,該方法得到的測(cè)定結(jié)果實(shí)際上是大米中總鎘的含量?？傛k含量作為檢測(cè)指標(biāo)不能如實(shí)反映其食用安全性,更不能準(zhǔn)確地進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,應(yīng)該針對(duì)各種形態(tài)鎘制定相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)限量。

楊紅霞等［13］運(yùn)用體積排阻-高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜(size exclusion-high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry,SEC-HPLC-ICP-MS)聯(lián)用技術(shù)分析了印度芥菜中鎘的存在形態(tài),發(fā)現(xiàn)鎘主要以植物螯合肽(phytochelatin,PC)3-鎘(Cd)、植物螯合肽(PC)2-鎘(Cd)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)-鎘(Cd)及半胱氨酸(cysteine,Cys)-鎘(Cd)這4種有機(jī)形態(tài)存在。李彬等［14］采用凝膠色譜-高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析了富鎘蕨類植物根系中鎘的總量及其形態(tài)分布。但是目前國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中均無(wú)測(cè)定稻米中離子態(tài)鎘(Cd2+)的方法。本實(shí)驗(yàn)研究建立了稻米中離子態(tài)鎘(Cd2+)的分析方法,并分析了部分抽檢的鎘超標(biāo)稻米(鎘含量＞0.2 mg/kg)中離子態(tài)鎘(Cd2+)的含量,以期為科學(xué)評(píng)估稻米中鎘的食用風(fēng)險(xiǎn),保障我國(guó)稻米食用安全提供進(jìn)一步的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝酸(分析純)：德國(guó)Merck公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

Cd2+標(biāo)準(zhǔn)使用液：將1 000μg/mL Cd2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)稀釋為10.0μg/mL Cd2+的標(biāo)準(zhǔn)使用液,置于4℃保存?zhèn)溆?由10.0μg/mL Cd2+標(biāo)準(zhǔn)使用液經(jīng)浸提液稀釋成4.0μg/L、8.0μg/L、12.0μg/L、16.0μg/L和20.0μg/L的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)系列使用液,使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate3000高效液相色譜儀(配有自動(dòng)進(jìn)樣器)：美國(guó)DIONEX公司；CS5A陽(yáng)離子交換色譜柱(4mm×250mm)、CG5A保護(hù)柱(4 mm×50 mm)、Icap QC電感耦合等離子體-質(zhì)譜(ICP-MS)儀(配有碰撞反應(yīng)池,形態(tài)分析全自動(dòng)處理接口)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；900T原子吸收光譜儀：美國(guó)PE公司；MULTIWAVE PRO微波消解儀、Monowave 450微波萃取儀：奧地利安東帕(中國(guó))有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品中總鎘的測(cè)定

將稻米磨碎混勻,稱取樣品約0.5 g(精確至0.001 g)于微波消解管中,加10 mL硝酸加蓋放置1 h,于微波消解儀中消解。消解完畢后,將微波消解管放入趕酸器中加熱1～2 h后,然后轉(zhuǎn)移消化液至離心管中,用水少量多次洗滌消化管,洗液合并,定容至50 mL,同時(shí)制備空白。用石墨爐原子吸收光譜儀測(cè)定試樣及試劑空白中鎘含量［15］。

1.3.2 樣品中無(wú)機(jī)離子鎘(Cd2+)測(cè)定

稱取約1 g(精確至0.001 g)磨碎混勻的稻米樣品于萃取管中,按照料液比1∶20(g∶mL)加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH7.20),50℃條件下微波萃取10 min,將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,重復(fù)提取一次,合并提取液,于3 900 r/min離心30 min,上清液用0.45μm的水系微孔濾膜過(guò)濾,濾液上HPLC-ICP-MS測(cè)定無(wú)機(jī)離子鎘(Cd2+)含量,其計(jì)算公式如下：

式中：C為樣品溶液的質(zhì)量濃度,μg/L；C0為試劑空白溶液的質(zhì)量濃度,μg/L；V為樣品定容體積,mL；m為試樣質(zhì)量,g；X為試樣的無(wú)機(jī)離子鎘含量,mg/kg。

HPLC-ICP-MS主要工作參數(shù)：射頻功率1 550 W,等離子體氣流速14 L/min,霧化氣流速0.89 L/min,輔助氣流速1.1 L/min,檢測(cè)器模擬電壓：-1 825 V,檢測(cè)器脈沖電壓：1 100 V,采樣時(shí)間8 min；浸提液50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.20)；流動(dòng)相組成：60 mmol/L草酸+100 mmol/L LiOH,使用前經(jīng)過(guò)0.45μm濾膜過(guò)濾并超聲脫氣。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+分離與檢測(cè)

以鎘超標(biāo)稻米中無(wú)機(jī)離子鎘(Cd2+)為研究目標(biāo),采用CS5A陽(yáng)離子交換色譜柱(4 mm×250 mm)對(duì)稻米樣品提取液中無(wú)機(jī)離子鎘進(jìn)行選擇性分離并進(jìn)行ICP-MS檢測(cè),由于重金屬對(duì)陽(yáng)離子交換樹脂有較強(qiáng)的親和力,選擇弱有機(jī)酸草酸與Cd2+形成配合物將其從陽(yáng)離子交換柱中洗脫出來(lái),為了提高草酸解離度,采用LiOH提高流動(dòng)相pH值,同時(shí)也是由于Li+相對(duì)于其他金屬離子對(duì)固定相的親和力低的原因。經(jīng)過(guò)方法驗(yàn)證,確定分離Cd2+的最佳流動(dòng)相組成為60 mmol/L草酸+100 mmol/L LiOH。按1.3.2方法對(duì)鎘超標(biāo)稻米樣品進(jìn)行處理,提取液中Cd2+用LC-ICP-MS進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見圖1。由圖1可知,該條件下Cd2+分離良好且無(wú)雜峰干擾,Cd2+的保留時(shí)間為4.5 min。對(duì)于元素形態(tài)研究,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需保持樣品中鎘元素的形態(tài)不發(fā)生轉(zhuǎn)化,本研究選取Tris-HCl緩沖溶液(pH7.20)為提取劑。雖然用流動(dòng)相做提取劑可以保持進(jìn)樣溶液具有與流動(dòng)相一致的條件來(lái)消除系統(tǒng)峰的干擾［16］。但是本實(shí)驗(yàn)采用的流動(dòng)相草酸是一種絡(luò)合劑,可與Cd2+絡(luò)合形成配合物,可能對(duì)Cd2+保留洗脫有影響,因此不適合用作提取劑。將Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液用浸提液逐級(jí)稀釋成4.0μg/L,8.0μg/L,12.0μg/L,16.0μg/L和20.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,Cd2+標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的分離色譜圖見圖2。以Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),積分強(qiáng)度(y)為縱坐標(biāo),擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程線性相關(guān)系數(shù)R=0.998。

圖1 稻米樣品萃取液中HPLC-ICP-MS分析Cd2+色譜圖Fig.1 Chromatography of Cd 2+in extraction of rice sample analysis by HPLC-ICP-MS

圖2 HPLC-ICP-MS分析Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of Cd 2+standard solution analysis by HPLC-ICP-MS

2.2 提取條件的選擇

2.2.1 萃取時(shí)間的選擇

以稻米樣品為試驗(yàn)對(duì)象,在其他條件一定的情況下,設(shè)定微波萃取時(shí)間分別為5min、10min、20min、30min、60min、120 min進(jìn)行提取試驗(yàn),樣品中Cd2+提取結(jié)果見表1。由表1可知,提取時(shí)間在10 min內(nèi),稻米中離子態(tài)鎘(Cd2+)并未達(dá)到提取完全狀態(tài),在10 min后,萃取時(shí)間對(duì)提取效率影響不明顯(P＞0.05),說(shuō)明微波能量場(chǎng)可以快速將稻米中的離子態(tài)鎘(Cd2+)釋放出來(lái),故選擇10 min作為樣品萃取時(shí)間。

表1 萃取時(shí)間對(duì)Cd2+提取效率的影響Table 1 Effect of extraction time on Cd 2+extraction efficiency

2.2.2 萃取溫度的選擇

保持其他條件不變,分別在30℃、40℃、50℃、60℃和70℃溫度條件下對(duì)稻米樣品進(jìn)行微波萃取,考察萃取溫度對(duì)樣品中Cd2+提取效果,結(jié)果見圖3。由圖3可知,在50℃之前,Cd2+提取量隨溫度的升高而增加,在此之后基本不變,故本實(shí)驗(yàn)選擇50℃作為萃取溫度。

圖3 萃取溫度對(duì)Cd 2+提取效率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on Cd 2+extraction efficiency

2.3 精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取3個(gè)稻米樣品各5份進(jìn)行Cd2+含量測(cè)定實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知,3個(gè)稻米樣品Cd2+含量平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均＜10%,表明該方法精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision experiments

2.3.2 方法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取2個(gè)Cd2+含量已知的稻米樣品分別進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知,試樣中Cd2+加標(biāo)回收率在85.1%～91.6%,表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確度高。

表3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate experiments

2.3.3 方法檢出限和定量限

以3倍的信噪比作為依據(jù)來(lái)考察本方法檢出限,通過(guò)試驗(yàn)可得本方法檢出限為0.005mg/kg,方法定量限為3倍的方法檢出限即0.015 mg/kg。

2.4 稻米樣品分析

運(yùn)用本方法測(cè)定了監(jiān)督抽檢稻米中部分鎘超標(biāo)樣品(鎘含量＞0.2 mg/kg)中無(wú)機(jī)離子態(tài)鎘(Cd2+)和總鎘的含量,并且分析了Cd2+占總鎘含量的比例,結(jié)果見表4。

表4 稻米樣品中無(wú)機(jī)離子鎘和總鎘的分布狀態(tài)Table 4 Distribution of inorganic cadmium ion and total cadmium in rice samples

由表4可知,29個(gè)稻米樣品中離子態(tài)鎘(Cd2+)對(duì)總鎘含量占比最低為6.95%,最高為23.50%?？梢姷久字写蟛糠宙k以有機(jī)結(jié)合態(tài)存在,結(jié)論進(jìn)一步說(shuō)明對(duì)稻米開展鎘的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估可能需要結(jié)合鎘的形態(tài)分析才會(huì)更有說(shuō)服力。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ICP-MS)分析測(cè)定稻米樣品中無(wú)機(jī)離子鎘(Cd2+),方法線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R=0.998,精密度試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＜10%,加標(biāo)回收率85.1%～91.6%,方法檢出限為0.005 mg/kg,表明該方法具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確度。運(yùn)用此方法測(cè)定了抽檢稻米中部分鎘超標(biāo)樣品中無(wú)機(jī)離子鎘(Cd2+)的含量,并分析了其占樣品中總鎘含量比例,發(fā)現(xiàn)稻米中無(wú)機(jī)離子鎘(Cd2+)含量較低,鎘主要以有機(jī)鎘形態(tài)存在,為我國(guó)稻米食用安全評(píng)價(jià)提供重要的參考依據(jù)。

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