1.3.6.8-四溴咔唑降解菌的篩選與鑒定

，，

(浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014)

環(huán)境問題污染物包括日益增加的已知化學(xué)物質(zhì)、具有毒性效應(yīng)的新物質(zhì)以及偶然發(fā)現(xiàn)的新化合物.新化合物可以包括諸如人工添加劑(例如新型鹵代阻燃劑)[1-3]、個人護理產(chǎn)品(例如藥物)和副產(chǎn)品[4-5]以及目前受管制的污染物的代謝物和降解產(chǎn)物[6].大量的鹵代化合物有可能在環(huán)境中持續(xù)存在，具有生物蓄積性和毒性[7-10].近年來環(huán)境樣品中陸續(xù)被檢測出鹵代咔唑，且已被確定為持久性有機污染物(POPs)，這些咔唑主要存在于沉積物和土壤樣品中[11-15].大多數(shù)的鹵代咔唑在有機污染物的針對性分析中被發(fā)現(xiàn)，包括溴化阻燃劑[11,14]和有機氯農(nóng)藥[16]，或者其他潛在污染物，如多環(huán)芳烴(PAHs)、多氯二惡英和呋喃(PCDD/Fs)以及多氯聯(lián)苯(PCBs)[13,15,17].

由于20世紀工業(yè)有機化學(xué)的興起，許多鹵代化合物及其副產(chǎn)品大量涌入環(huán)境中.有關(guān)氯代咔唑的發(fā)現(xiàn)，最早報道之一是在20世紀80年代初，紐約布法羅河被一個工廠工業(yè)染料廢棄物所污染[17].在此之后的30 年里，在德國的土壤和沉積物[14,16]、希臘的海洋沉積物[16]以及北美大湖地區(qū)的淡水湖泊和河流沉積物中均有關(guān)于鹵化咔唑的報道[11-13].在對持久性有機污染物的降解過程中，生物降解法無疑是眾多降解方法中對環(huán)境的二次污染影響最小的方法之一[17]，且生物降解一直被廣泛地運用于環(huán)境修復(fù)[18].

1 材料與儀器

1.1 菌種來源

樣品采自蘇州某制藥廠的受污染土壤，土壤經(jīng)多點采樣后，混合均勻.

1.2 培養(yǎng)基

無機鹽培養(yǎng)基(MSM)[19-20]：將1.00 g NaCl，1.00 g (NH4)2SO4，1.50 g K2HPO4，0.50 g KH2PO4和0.20 g MgSO4·7H2O溶于離子水中并定容至1 L，自然pH值，分裝至錐形瓶中，在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min.其固體培養(yǎng)基則需另加入體積比為2.0%的瓊脂粉.

LB培養(yǎng)基：將10.0 g酵母粉，5.0 g蛋白胨，10.0 g氯化鈉溶解在去離子水中并定容至1 L，自然pH值，裝至錐形瓶中，在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min.固體培養(yǎng)基則需另加入體積比為2.0%的瓊脂粉.

微量元素溶液[21-23]：將0.13 g MnSO4·H2O，0.23 g ZnCl2，0.03 g CuSO4·H2O，0.42 g CoCl2·6H2O，0.15 g Na2MoO4·2H2O和0.05 g AlCl3·6H2O溶解在去離子水中并定容至1 L，備用.

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的純化與分離

稱取5 g土壤樣品置于100 mL含1 mg/L1.3.6.8-四溴咔唑的無機鹽培養(yǎng)中，置于30 ℃，180 r/min恒溫搖床中好氧培養(yǎng)一周.取5 mL上清液轉(zhuǎn)移至新的100 mL含1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑的無機鹽培養(yǎng)集中，相同條件下再培養(yǎng)一周，重復(fù)上述操作4 次.

從最后一次富集的培養(yǎng)液中取5 mL進行稀釋，稀釋倍數(shù)分別為10倍，100倍和1 000倍.取0.1 mL稀釋后的溶液分別涂布在含1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑的無機鹽固體培養(yǎng)基上，倒置在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，待培養(yǎng)基上的菌落長到合適大小時，挑取不同形態(tài)的菌落分別在不同的LB固體培養(yǎng)基上劃線，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).重復(fù)上一步操作數(shù)次，直至每塊培養(yǎng)皿中的菌落單一.

將每株單菌接種至液體LB培養(yǎng)集中擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，8 000 r/min離心8 min.用新鮮的MSM清洗菌液2次.將清洗干凈的菌體轉(zhuǎn)移至含有1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑的MSM液體培養(yǎng)集中制成降解液，30 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng).

將降解液用等體積二氯甲烷萃取，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液用乙腈換相，用氮吹儀將降解液轉(zhuǎn)移至2 mL棕色進樣瓶中并定容至1 mL.用HPLC驗證1.3.6.8-四溴咔唑的降解情況.其中，分析柱為Grace Alltima?C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Grace公司)，流速0.8 mL/min，檢測波長為246 nm.

1.3.2 菌株的鑒定

通過觀察細菌形態(tài)，細菌生理生化特性及其16S rDNA序列對細菌種屬進行鑒定.菌株生理生化特征參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[24].16S rDNA序列交由上海生工生物工程股份有限公司完成.將測試結(jié)果對比Genbank中相關(guān)16S rDNA序列，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 菌株降解的條件優(yōu)化

降解液的制備：將降解菌接種至LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液8 000 r/min離心8 min，用新鮮無機鹽洗滌2次，將清洗干凈的菌液轉(zhuǎn)移至含1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑的無機鹽中.

1.4.1 溫度對菌株降解的影響

按上述方法配制降解液，確保降解液中的OD600=1.5，將若干制備好的降解液平均分為5 份，分別放置在溫度為22，30，38，46，54 ℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床上培養(yǎng).

1.4.2 pH對菌株降解的影響

按照上述方法配制新的降解液，將若干制備好的降解液平均分為5 份，每份降解液pH值分別調(diào)節(jié)至5，6，7，8，9，放置在30 ℃，180 r/min的搖床上培養(yǎng).

1.4.3 不同底物質(zhì)量濃度對菌株降解的影響

將清洗干凈的菌體轉(zhuǎn)移至MSM液體培養(yǎng)基中，制成種子液，將若干種子液平均分為5 份，分別添加1.3.6.8-四溴咔唑，使得每份種子液中1.3.6.8-四溴咔唑的質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1，5，10 mg/L，放置在30 ℃，180 r/min的搖床上培養(yǎng).

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種鑒定

土壤樣品富集數(shù)次以后，分離純化出一株能有效降解1.3.6.8-四溴咔唑的降解菌，命名為JW.該菌株為革蘭氏陽性菌，好氧，在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d后，菌落呈淡黃色，菌落大致為邊緣平整的圓形，表面光滑濕潤(圖1).菌株JW能夠利用葡萄糖、乳糖、蔗糖和甘露糖，對卡那霉素、氨芐青霉素、鏈霉素和氯霉素等抗生素都具有抗性.16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，根據(jù)其同源性分析得知：該菌被鑒定為Stenotrophomonassp..

圖1 菌株JW在LB培養(yǎng)基上生長3 d的菌落圖Fig.1 The colonies of strain JW cultured in LB for 3 days

圖2 菌株JW的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree by strain JW

2.2 菌株降解的條件優(yōu)化

2.2.1 溫度對菌株降解的影響

將放置在不同溫度搖床中的錐形瓶培養(yǎng)20 d后取出，按照1.3.1中所述方法測定剩余1.3.6.8-四溴咔唑的含量.圖3結(jié)果顯示：菌株JW受溫度的影響較大，當溫度大于或小于30 ℃時，降解效率明顯下降，當溫度升高至50 ℃以上時，其降解效率甚至不足10%.由此可知，降解菌JW的最適溫度為30 ℃.

2.2.2 pH對菌株降解的影響

將不同pH值的錐形瓶在相同條件下培養(yǎng)20 d后取出，按照1.3.1中所述方法測定剩余1.3.6.8-四溴咔唑的含量.圖4結(jié)果顯示：菌株JW更適合在中性條件下生長，當pH值大于或小于7時，降解效率會受到一定的影響.由此可知，降解菌JW的最適酸堿度為中性.

圖3 溫度對JW降解效率的影響Fig.3 Effect of temperature on degradation by strain JW

圖4 pH值對JW降解效率的影響Fig.4 Effect of pH on degradation by strain JW

2.2.3 底物初始質(zhì)量濃度對菌株降解的影響

每隔4 d從30 ℃搖床中各取出3 瓶不同底物質(zhì)量濃度的樣品，按照1.3.1中所述方法測定剩余1.3.6.8-四溴咔唑的含量.圖5結(jié)果顯示：菌株JW的降解效率大致與底物質(zhì)量濃度成反比，即1.3.6.8-四溴咔唑質(zhì)量濃度越低，菌株JW的降解速率就越快.

圖5 初始質(zhì)量濃度對JW降解效率的影響Fig.5 Effect ofinitial concentration on degradation by strain JW

3 結(jié) 論

從蘇州某制藥廠受污染土壤中篩選出一株能夠有效降解1.3.6.8-四溴咔唑的菌株JW.該菌株在LB培養(yǎng)基上呈淡黃色、圓形、邊緣平整、表面光滑、隆起，經(jīng)16S rDNA序列鑒定為Stenotrophomonassp..該菌株可以在20 d內(nèi)降解80% 1 mg/L 1.3.6.8-四溴咔唑，之后以緩慢的速率降解，直到50 d左右1.3.6.8-四溴咔唑基本降解完全.菌株JW在30℃，pH=7時降解效率最高，為鹵代咔唑類化合物的生物降解提供了理論基礎(chǔ).

參考文獻：

[1] POMA G, ROSCIOLI C, GUZZELLA L. Evaluation of spatial distribution and accumulation of novel brominated flame retardants, HBCD and PBDEs in an Italian subalpine lake using zebra mussel[J].Environmental science &pollution research international, 2014, 186(4):7683-7692.

[2] CEQUIER E, BECHER G, THOMSEN C. Human exposure pathways to organophosphate triesters-a biomonitoring study of mother-child pairs [J].Environmental science technology letter, 2014, 1(1):82-86.

[3] BALLESTEROSGOMEZ A, BOER J D, LEONARDS P E. A novel brominated triazine-based flame retardant (ttbp-taz) in plastic consumer products and indoor dust [J].Environmental science & technology, 2014, 48(8):4468-4474.

[4] RUDD M A, ANKLEY G T, BOXALL A B. International scientists’ priorities for research on pharmaceutical and personal care products in the environment[J].Integrated environmental assessment & management, 2014, 10(4):576-587.

[5] BIRCH GF, DRAGE D S, THOMPSON K. Emerging contaminants (pharmaceuticals, personal care products, a food additive and pesticides) in waters of Sydney estuary, Australia [J].Marine pollution bulletin, 2015, 97(12):56-66.

[6] STUBBINGS W A, HARRAD S. Extent and mechanisms of brominated flame retardant emissions from waste soft furnishings and fabrics:a critical review [J].Environment international, 2014, 71:164-175.

[7] BALLESTEROSGOMEZ A, BRANDSMA S H, DE B J. Analysis of two alternative organophosphorus flame retardants in electronic and plastic consumer products:resorcinol bis-(diphenylphosphate) (PBDPP) and bisphenol A bis (diphenylphosphate) (BPA-BDPP)[J].Chemosphere, 2014, 406(34):2503-2512.

[8] GAGOFERRERO P, SCHYMANSKI E L, BLETSOU A A. Extended suspect and non-target strategies to characterize emerging polar organic contaminants in raw wastewater with LC-HRMS/MS[J].Environmental science & technology, 2015, 49(20):12333-12341.

[9] ABDALLAH M A, ZHANG J, PAWAR G. High-resolution mass spectrometry provides novel insights into products of human metabolism of organophosphate and brominated flame retardants[J].Analytical & bioanalytical chemistry, 2015, 407(7):1871-1883.

[10] JOBST K J, SHEN L, REINER E J. The use of mass defect plots for the identification of (novel) halogenated contaminants in the environment[J].Analytical & bioanalytical chemistry, 2013, 405(23):3289-3297.

[11] GUO J, CHEN D, POTTER D. Polyhalogenated carbazoles in sediments of lake Michigan:a new discovery[J].Environmental science & technology, 2014, 48(3):12807-12815.

[12] WU Y, MOORE J, GUO J. Multi-residue determination of polyhalogenated carbazoles in aquatic sediments [J].Journal of chromatography A, 2016, 1434(23):111-118.

[13] ABAURREAM P, JOBST K J, RUFFOLO R. Identification of potential novel bioaccumulative and persistent chemicals in sediments from Ontario (Canada) using scripting approaches with GC×GC-TOF MS analysis[J].Environmental science & technology, 2014, 48(35):9591-9599.

[14] TROBS L, HENKELMANN B, LENOIR D. Degradative fate of 3-chlorocarbazole and 3, 6-dichlorocarbazole in soil[J].Environmental science & pollution research, 2011, 18(32):547-555.

[15] PENG H, CHEN C, SAUNDERS D M. Untargeted screening and distribution of organo-bromine compounds in sediments of lake Michigan[J].Environmental science & technology, 2015, 87(12):10237-10246.

[16] REISCHL A, JONECK M. Chlorcarbazole in B?den [J].Umweltwissenschaften und schadstoff-forschung, 2005, 17(45):197-200.

[17]GRIGORIADOU A, SCHWARZBAUER J. Non-target screening of organic contaminants in sediments from the industrial coastal area of Kavala city (NE Greece) [J].Water air & soil pollution, 2011, 214(5):623-643.

[18] 胡志杭,徐士博,祝飛,等.二氯甲烷高效降解菌株的誘變選育[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,39(1):7-12.

[19] 江吉紅,商弘穎,吳立飛,等.尼古丁降解菌的分離鑒定和初步特性研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2012,39(6):614-618.

[20] 邱樂泉,楊琳,鐘衛(wèi)鴻.一株脫有機硫菌AgrobateriumtumefaciensW3的分離鑒定及特性的研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,37(5):520-524.

[21] 李娟,齊俊生,王婷,等.IPTG添加時機對大腸桿菌產(chǎn)α-酮基丁酸的影響[J].發(fā)酵科技通訊,2017,46(2):78-82.

[22] 樓堅,申雨珂,劉夢云,等.牛乳中嗜冷菌的PCR快速檢測[J].發(fā)酵科技通訊,2017,46(1):36-41.

[23] 歐志敏,馬蘭.蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的分批發(fā)酵動力學(xué)[J].發(fā)酵科技通訊,2017,46(1):2-5.

[24] 蔡妙英,東秀珠.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001.