他克莫司的發(fā)酵生產(chǎn)研究

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(1.杭州華東醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，浙江 杭州 311000；2.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院 浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014)

他克莫司(Tacrolimus)，又名FK506，是從筑波鏈霉菌發(fā)酵液中提取得到的一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，主要通過抑制T細(xì)胞活化相關(guān)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的表達(dá)發(fā)揮免疫抑制作用，其IC50為環(huán)孢素A的1%[1].1984年由日本藤澤藥品工業(yè)公司開發(fā)，其后國內(nèi)外大力進(jìn)行了他克莫司的基礎(chǔ)和臨床研究.該產(chǎn)品為單水合物，白色或類白色結(jié)晶性粉末，幾乎不溶于水，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、醋酸乙酯、乙醚、苯酚和氯仿[2-3]，具有藥效強(qiáng)、使用劑量低、移植物存活率高和急性排斥反應(yīng)發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)[4].目前，國內(nèi)的免疫抑制劑市場已經(jīng)達(dá)到100 億元的規(guī)模，其中國內(nèi)重點(diǎn)城市公立醫(yī)院他克莫司用藥金額為5.03 億元，而全球他克莫司市場一直處于20多億美元的規(guī)模，他克莫司已成為器官移植免疫抑制劑市場的領(lǐng)頭羊.

他克莫司作為一種具有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)和重要藥理活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，其生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法.他克莫司的化學(xué)合成法最早是由Merck公司開發(fā)的不對稱Evans-Aldol縮合反應(yīng)法[5]，該方法先通過合成各關(guān)鍵片段再進(jìn)行結(jié)構(gòu)單元的組裝得到最終產(chǎn)品，但由于他克莫司的分子量大、手性及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此在合成過程中所需步驟較多，合成效率相對較低.隨著研究者們對合成方法的不斷探索和改進(jìn)，發(fā)展了新的合成方法，并改進(jìn)了部分結(jié)構(gòu)單元的合成路徑，衍化出目前較常用的匯聚式合成策略[6].但由于化學(xué)合成方法的限制較多，隨著人們對他克莫司生物合成機(jī)制及特異性前體形成機(jī)制研究的不斷深入，科研人員可以通過基因工程改造的方法獲得產(chǎn)量提高、組分優(yōu)化的新一代他克莫司生產(chǎn)菌株.研究者們通過位點(diǎn)特異性整合的方法獲得了基因重組菌，其生產(chǎn)能力較原始菌株提高了120%.2003年，Kang等[7]篩選到了一株高產(chǎn)他克莫司的鏈霉菌StreptomycesclavuligerusCKD1 119，并提供了一種高產(chǎn)他克莫司的方法，經(jīng)過7～8 d的發(fā)酵，最終得到350 mg/L的他克莫司.后期研究者們不斷對菌株進(jìn)行改良和發(fā)酵條件優(yōu)化，最終其生產(chǎn)能力有了很大的提高.此外，在他克莫司的下游分離提取方面，因發(fā)酵液中含有較多的成分，且他克莫司在含水溶媒體系中易發(fā)生互變異構(gòu)[8]，大大增加了精制過程的難度，一般認(rèn)為不能以反相柱色譜精制.Kino[9]和Okuhara[10]報道了他克莫司的分離提取方法，但都難以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn).筆者通過選育高產(chǎn)突變株，突破發(fā)酵工藝的關(guān)鍵技術(shù)，改進(jìn)下游分離純化工藝，全面提高發(fā)酵水平，降低雜質(zhì)含量，大幅降低生產(chǎn)成本，獲得先進(jìn)的他克莫司生產(chǎn)新工藝.

1 材料與方法

1.1 菌 種

筑波鏈霉菌(Streptomycestssukubaensis)No 9993，由實(shí)驗(yàn)室分離并保藏.

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

麥芽浸出粉20 g/L，酵母浸出粉5 g/L，葡萄糖10 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.0.

1.2.2 種子培養(yǎng)基

可溶性淀粉10 g/L，甘油10 g/L，干酵母5 g/L，玉米漿10 g/L，葡萄糖10 g/L，CaCO32 g/L，pH 7.0.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

糊精7%，固體玉米漿0.5%，啤酒酵母粉1.7%，面包酵母粉0.6%，L-異亮氨酸0.5%，硫酸銨0.1%，碳酸鈣0.25%，泡敵0.3%.

1.2.4 補(bǔ)料培養(yǎng)基

糊精7%，固體玉米漿0.5%，啤酒酵母粉1.7%，面包酵母粉0.6%，L-異亮氨酸0.5%，硫酸銨0.1%，碳酸鈣0.25%，泡敵0.3%，固體玉米漿0.1%，啤酒酵母粉0.5%，pH 9.0±0.5.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 補(bǔ)料分批發(fā)酵方法

從新鮮斜面上挑取1 環(huán)菌接種到20 mL種子培養(yǎng)基中，300 r/min培養(yǎng) 40 h，制備一級種子，按體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中.

1.3.2 活性炭脫色損失計算

在萃取液中分別加入20 g/L的活性炭，攪拌2 h后過濾，得到濾液.

脫色損失率=(U萃取-U濾液)/U萃取×100%

式中：U萃取為萃取液效價；U濾液為濾液效價.

2 結(jié)果與討論

2.1 種子液碳源的篩選

淀粉是發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的必需碳源之一，但含淀粉的培養(yǎng)基黏度極高，從而影響發(fā)酵過程的供氧.為了探究種子對不同碳源的利用情況和適應(yīng)程度，考察了五種不同碳源(玉米淀粉(10 g/L)、可溶性淀粉(10 g/L)、甘油(10 g/L)、葡萄糖(5 g/L)和麥芽糊精(10 g/L))對種子生長(38 h)及對發(fā)酵產(chǎn)他克莫司的影響.結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同碳源對發(fā)酵效價的影響Fig.1 The effect of carbon source on fermentation titer

由圖1可知：種子液碳源為葡萄糖、可溶性淀粉和麥芽糊精時，發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的效價均較高；而用玉米淀粉和甘油為碳源時，發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的效價相對較低.后期通過鏡檢發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為種子液碳源時菌絲生長快，菌絲體粗壯，菌絲生長呈網(wǎng)狀，染色深，菌體對生長環(huán)境具有較大的耐受能力.

2.2 種子液中葡萄糖用量的優(yōu)化

對種子培養(yǎng)基中碳源葡萄糖的質(zhì)量濃度進(jìn)行考察.種子培養(yǎng)48 h后移入發(fā)酵培養(yǎng)基，考察種子培養(yǎng)基中葡萄糖的添加量對發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的影響，以確定葡萄糖的最適用量.結(jié)果如圖2所示.

圖2 種子液中葡萄糖添加量對發(fā)酵效價的影響Fig.2 The effect of addition of glucose on fermentation titer

種子液中葡萄糖質(zhì)量濃度的高低會影響菌體生長速率，進(jìn)而影響后續(xù)代謝產(chǎn)物的合成，因此需要選擇合適的葡萄糖質(zhì)量濃度以優(yōu)化菌體的代謝過程.由圖2可知：種子培養(yǎng)過程中碳源葡萄糖的質(zhì)量濃度為1.5 g/L時，后續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的水平可以達(dá)到287 μg/mL，此時菌絲鏡檢成網(wǎng)成團(tuán)，菌絲粗壯，染色深.當(dāng)種子液中的葡萄糖質(zhì)量濃度較低時種子液中的碳源減少，種子生長速率下降；而當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度過高時，菌種生長速率過快，積累大量代謝副產(chǎn)物.因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得到的1.5 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度適合菌體生長代謝.

2.3 種子培養(yǎng)時間的確定

選用1.5 g/L葡萄糖作為種子碳源后，種子生長較快，生長周期發(fā)生了變化.種子培養(yǎng)時間直接影響產(chǎn)物的生成，為了確定較適宜的接種時間，實(shí)驗(yàn)分別選取不同種齡(24，32，40，48，56 h)的種子接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，并最終以發(fā)酵液中的他克莫司效價判斷發(fā)酵的結(jié)果.結(jié)果如圖3所示.

圖3 種子培養(yǎng)時間對發(fā)酵效價的影響Fig.3 The effect of seed incubating time on fermentation titer

由圖3可知：當(dāng)種子培養(yǎng)時間分別為24，48，56 h時，轉(zhuǎn)接后發(fā)酵液中的他克莫司質(zhì)量濃度均較低，這是由于種子培養(yǎng)時間過短時，種子活力不夠，而當(dāng)種子培養(yǎng)時間過長時，種子進(jìn)入平臺期，此時種子活力差，狀態(tài)也不穩(wěn).當(dāng)種子培養(yǎng)至40 h時，轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，他克莫司的效價最高，此時的種子活性較高，狀態(tài)穩(wěn)，發(fā)酵水平和發(fā)酵液質(zhì)量提高.因此，最終選取40 h為最佳接種時間.

2.4 不同接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響

種子液的接種量會影響菌體的延滯期：接種量大，則延滯期短，菌體生長迅速，降低了產(chǎn)物的產(chǎn)量；接種量小，延滯期長，菌體生長緩慢，同樣不利于產(chǎn)物的積累.因此需要考察接種量對效價的影響.將種齡為40 h的種子按不同接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，考察不同接種量對發(fā)酵效價的影響.結(jié)果如圖4所示.

圖4 接種量對發(fā)酵效價的影響Fig.4 The effect of inoculation amount on fermentation titer

由圖4可知：當(dāng)接種量逐漸升高時，發(fā)酵的效價呈明顯下降的趨勢，這是因?yàn)榻臃N量增大時，菌體生長速率較快，大量消耗發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，導(dǎo)致用于代謝合成他克莫司的直接碳源大大減少，并且加劇了發(fā)酵液中副產(chǎn)物的積累.通過本實(shí)驗(yàn)可知：當(dāng)接種量為10%時，發(fā)酵液中他克莫司的質(zhì)量濃度最高.

2.5 發(fā)酵過程放大的研究

由搖瓶發(fā)酵放大到發(fā)酵罐發(fā)酵時，各方面條件有所變化，特別是對發(fā)酵條件的控制，如溫度、溶解氧、pH值和裝液量等主要參數(shù)的控制方式與搖瓶不同，會造成發(fā)酵結(jié)果與搖瓶的差異性，因此進(jìn)行放大研究，評估裝液量和溶氧等影響因素對發(fā)酵過程的影響.

2.5.1 裝液量對發(fā)酵結(jié)果的影響

他克莫司的發(fā)酵屬于好氧性發(fā)酵，在搖瓶發(fā)酵過程中，影響溶氧的因素主要是搖瓶的裝液量和搖床的轉(zhuǎn)數(shù).控制搖床的轉(zhuǎn)數(shù)為300 r/min，在500 mL搖瓶中測定不同裝液量對發(fā)酵結(jié)果的影響.結(jié)果如圖5所示.

圖5 裝液量對發(fā)酵效價的影響Fig.5 The effect of loading volume on fermentation titer

由圖5可知：500 mL搖瓶的裝液量為20 mL時，發(fā)酵液中他克莫司產(chǎn)量最高.這是因?yàn)樵谠撗b液量下，溶氧較高，有利于他克莫司的積累，并減少了副產(chǎn)物的生成.從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)裝液量是影響搖瓶發(fā)酵溶氧的重要因素.在發(fā)酵轉(zhuǎn)速一定時，裝液量越低，發(fā)酵液中的溶氧越高.但是在發(fā)酵過程中裝液量過低時，由于培養(yǎng)基水分蒸發(fā)等因素造成的發(fā)酵液體積變化較大，并且隨著菌體發(fā)酵代謝的不斷進(jìn)行，發(fā)酵液中營養(yǎng)成分不足導(dǎo)致發(fā)酵過程中產(chǎn)他克莫司的水平下降.

2.5.2 溶氧對發(fā)酵結(jié)果的影響

在筑波鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)過程中，溶氧是影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素，對微生物的生長和產(chǎn)物形成有重要的影響.要根據(jù)氧的溶解特性及微生物對氧的需求，分析溶氧對發(fā)酵的影響及對發(fā)酵產(chǎn)物的影響，進(jìn)而確定溶氧量的控制及在發(fā)酵液中的傳遞，使生產(chǎn)效益最大化.筆者在20 t發(fā)酵罐中研究了10%，20%，30%溶氧對發(fā)酵產(chǎn)他克莫司產(chǎn)量的影響.結(jié)果如圖6所示.

圖6 溶氧對發(fā)酵效價的影響Fig.6 The effect of dissolved oxygen on fermentation titer

由圖6可知：發(fā)酵前期，溶氧高低對發(fā)酵生產(chǎn)他克莫司的影響較小，溶氧較低時發(fā)酵效價相對較低.當(dāng)溶氧超過20%時，他克莫司產(chǎn)量變化不明顯.此外，可以發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵后期溶氧高低對發(fā)酵結(jié)果影響不大，發(fā)酵效價處在一個穩(wěn)定的水平，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵中后期，菌絲體對溶氧的要求不高.因此在發(fā)酵對數(shù)生長期可以提高溶氧，促使菌體生長和代謝，在發(fā)酵中后期可以考慮降低空氣供應(yīng)量，同時降低攪拌轉(zhuǎn)速，以此來節(jié)能降耗，降低成本.

2.5.3 分批補(bǔ)料發(fā)酵過程優(yōu)化

根據(jù)前期搖瓶補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及放大控制條件摸索，采用優(yōu)化后的工藝配方，進(jìn)行20 t罐補(bǔ)料放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵過程中溶氧控制在20%以上，并在發(fā)酵中后期進(jìn)行補(bǔ)料.結(jié)果如圖7所示.

圖7 分批補(bǔ)料發(fā)酵過程曲線Fig.7 Fermentation process curve of feed-batch

由圖7可知：補(bǔ)料工藝的他克莫司質(zhì)量濃度達(dá)到1 150 μg/mL，產(chǎn)量有大幅度提升.實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只在發(fā)酵第4天進(jìn)行補(bǔ)料，對他克莫司產(chǎn)量影響較小.而在發(fā)酵第4天和第5天連續(xù)補(bǔ)料時，產(chǎn)量明顯提高.這是由于在發(fā)酵中后期菌體消耗糖等速率快，生長達(dá)到最高值，并大量合成他克莫司，此時進(jìn)行補(bǔ)料可以延緩菌體進(jìn)入衰亡期，提高菌體的生產(chǎn)發(fā)酵能力.

2.6 提取與精制過程工業(yè)化研究

在微生物發(fā)酵液中，存在許多蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)，為后續(xù)產(chǎn)品的分離純化帶來了很大的難度.在他克莫司的發(fā)酵液中還存在很多異構(gòu)體和類似物，主要雜質(zhì)有二氫他克莫司、子囊霉素等，其中子囊霉素與他克莫司只相差1 個亞甲基，而二氫他克莫司與他克莫司相差2 個氫原子，因此子囊霉素、二氫他克莫司與他克莫司的結(jié)構(gòu)極為相似(相似度95%以上)，在溶劑中的溶解性和對溶劑的親和力相近，因?yàn)檫@些物質(zhì)的存在，常規(guī)的分離純化方法無法完全分離他克莫司，產(chǎn)品達(dá)不到相應(yīng)的純度，純化分離難度極大，生產(chǎn)工藝水平低，工藝成本居高不下.

2.6.1 提取工藝優(yōu)化

為了除去發(fā)酵液中的色素等雜質(zhì)，篩選了不同品種的活性炭(活性炭PT-A303，活性炭8815，PT303-1和白鷺-Z)，考察脫色效果和粗品質(zhì)量.結(jié)果如圖8所示.

圖8 脫色材料的選擇Fig.8 Selection of decolorizing materials

由圖8可知：活性炭PT-A303的脫色損失最小，而且經(jīng)該脫色材料脫色后的結(jié)晶收率最高，這說明該脫色材料既能較好地吸附色素，而且對產(chǎn)品的吸附較少.脫色后，用V(乙酸乙酯)∶V(正庚烷)∶V(純水)=1∶3∶2的結(jié)晶溶劑對脫色液進(jìn)行濃縮結(jié)晶，30 ℃保溫1 h，冷卻至20 ℃，繼續(xù)攪拌2 h，過濾得到他克莫司粗品.

2.6.2 他克莫司層析技術(shù)

為了進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量，提高提煉收率，并實(shí)現(xiàn)他克莫司中結(jié)構(gòu)類似雜質(zhì)子囊霉素(FK520)和8-丙基他克莫司(2H-FK506)的有效分離，開發(fā)了針對FK506分離純化的Q5親和層析工藝，利用這種材料具有選擇性吸附某個化合物或某類結(jié)構(gòu)相似的化合物的特點(diǎn)，高親和性及高選擇性分離目標(biāo)化合物.選擇親和層析填料上的配基與FK506分子結(jié)構(gòu)上的C36雙鍵形成配位鍵，而類似物FK520和2H-FK506分子結(jié)構(gòu)上C36無雙鍵基團(tuán)，不能與本親和填料上的配基形成配位鍵，故本填料吸附FK506能力顯著大于類似物FK520和2H-FK506，從而達(dá)到徹底分離去除FK520及2H-FK506雜質(zhì)的目的，提高產(chǎn)品質(zhì)量及純化收率.以V(乙醇)∶V(乙酸乙酯)=45∶55的洗脫液洗脫分離FK520和2H-FK506雜質(zhì)，最終只需一次層析即可達(dá)到徹底分離去除FK520及2H-FK506的目的，收率達(dá)86.6%，他克莫司的純度達(dá)99.5%，F(xiàn)K520和2H-FK506雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.13%和0.2%.

3 結(jié) 論

通過研究不同發(fā)酵條件對他克莫司發(fā)酵的影響，獲得了最適搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件：種子培養(yǎng)基中以1.5 g/L葡萄糖為輔碳源，種子培養(yǎng)時間40 h，500 mL搖瓶裝液量為20 mL，接種量為10%；20 t發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)過程中溶氧控制在20%以上，發(fā)酵周期為7 d，發(fā)酵第4天和第5天進(jìn)行分批補(bǔ)料，最終發(fā)酵得到他克莫司的質(zhì)量濃度為1 150 μg/mL.優(yōu)化了他克莫司發(fā)酵液的提取和精制工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠的工業(yè)路線.粗提取時選擇活性炭PT-A303進(jìn)行萃取后脫色處理，經(jīng)V(乙酸乙酯)∶V(正庚烷)∶V(純水)=1∶3∶2混合溶劑對脫色濃縮液進(jìn)行結(jié)晶得到粗品.精制的過程中，采用Q5親和層析工藝，達(dá)到徹底分離去除FK520及2H-FK506等相似結(jié)構(gòu)雜質(zhì)的目的，收率達(dá)86.6%，他克莫司的純度達(dá)99.5%，F(xiàn)K520和2H-FK506雜質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.13%和0.2%.

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