蛻膜CXCR6+/-單核-巨噬細(xì)胞在人早孕期母胎界面的表型差異

劉倩倩，黃煜*，顏莉莉，張鵬，張清宇，杜美蓉

(1.青島大學(xué)附屬青島婦女兒童醫(yī)院，青島 266000；2.復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科研究所，上海 200000)

人早孕期母-胎界面主要發(fā)生三個(gè)生理事件：子宮內(nèi)膜蛻膜化、滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育與胎盤形成、母-胎之間的復(fù)雜對(duì)話。母胎界面形成中，子宮蛻膜聚攏了大量的免疫細(xì)胞，參與母胎免疫耐受的形成，其中蛻膜NK細(xì)胞(dNK)含量最多，約占50%～70%，蛻膜T細(xì)胞(dT)約占10%～15%，蛻膜單核巨噬細(xì)胞(dMΦ)約占10%～15%，幾乎不含有B細(xì)胞[1-2]。與dNK細(xì)胞不同的是，dMΦ在整個(gè)妊娠過程中數(shù)量并不會(huì)發(fā)生明顯的變化[3]。在不同微環(huán)境的誘導(dǎo)下單核-巨噬細(xì)胞可形成不同的表型，發(fā)揮不同的功能。根據(jù)表型和功能不同，單核巨噬細(xì)胞主要分為兩型即經(jīng)典M1型巨噬細(xì)胞，主要表達(dá)共刺激分子CD80和CD86，可分泌TNF-a、IL-8等大量的促炎性細(xì)胞因子，影響母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲，不利于胎盤的植入和妊娠的維持[4-5]。在正常母胎界面偏向于分化為非經(jīng)典的M2型巨噬細(xì)胞，主要表達(dá)表面分子CD206，可釋放大量的抗炎細(xì)胞因子如IL-10，抑制母體的免疫反應(yīng)，參與免疫耐受，有利于妊娠的維持[6-8]。

我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)人早孕滋養(yǎng)細(xì)胞可以分泌高水平CXCL16，通過與其唯一受體CXCR6相互作用選擇性的招募外周單核細(xì)胞聚集到蛻膜局部并且保持穩(wěn)定，從而促進(jìn)自身的生長(zhǎng)和侵襲；然而這些被募集而來的CXCR6+巨噬細(xì)胞在蛻膜局部的表型與功能如何，目前仍不明確[9]。因此在前期工作的基礎(chǔ)上，我們采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)正常早孕組和自然流產(chǎn)組婦女CXCR6+/-dMΦ的表型進(jìn)行分析，揭示其在母胎免疫耐受中可能的作用機(jī)制。

材料和方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)標(biāo)本： 于上海復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院門診手術(shù)室選擇正常早孕期(6～10周)行人工流產(chǎn)的患者40例及早孕期無(wú)明確原因自然流產(chǎn)患者20例。

正常早孕組的收集標(biāo)準(zhǔn)：20～35歲計(jì)劃外妊娠；術(shù)前無(wú)感染、發(fā)熱等其他基礎(chǔ)疾病。不明原因發(fā)生自然流產(chǎn)患者的收集標(biāo)準(zhǔn)：20～35歲，排除染色體異常、生殖道畸形、發(fā)熱等其他疾病。

本研究經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取得患者知情同意后，收集蛻膜組織于DMEM/F12培養(yǎng)液中，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM/F12培養(yǎng)液、PBS、RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco，美國(guó))；Percoll分離液，Collagenase Ⅳ(Sigma，美國(guó))；DNase I(Applichem，德國(guó))；流式抗體(Biolend，美國(guó))：APC anti-human CXCR6、FITC anti-human CD14、BV421 anti-human CD45、PE anti-human CXCR6、PE/CY7 anti-human CD80、CD206。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.分離蛻膜免疫細(xì)胞群(DIC)：將收集到的蛻膜組織置于100 mm的培養(yǎng)皿中，PBS充分洗滌，去除血塊，將組織充分剪碎(約1 mm×1 mm×1 mm)，吸入50 ml離心管中，加入0.1 % DNase I及0.1% Collagenase Ⅳ，放入37℃搖床震蕩消化30～40 min。將消化后的組織依次經(jīng)過100目、300目、400目的濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1 500 rpm離心8 min，去上清液，將細(xì)胞重懸于2 ml RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，然后平鋪于20%、40%、60% 3個(gè)梯度的Percoll分離液上，2 500 rpm離心20 min。40%～60%密度區(qū)域的細(xì)胞即為分離的蛻膜免疫細(xì)胞群，將細(xì)胞洗滌并重懸于DMEM/F12培養(yǎng)液中備用。

2.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)dMΦ表面分子的表達(dá)：將分離的蛻膜免疫細(xì)胞用PBS充分洗滌后，根據(jù)樣本的細(xì)胞數(shù)和抗體推薦用量加入CXCR6、CD45、CD14及表面分子CD80、CD206流式抗體，4℃避光孵育30 min，充分洗滌后加入適量PBS重懸，采用Beckman流式儀(型號(hào)CyAn ADP)檢測(cè)，F(xiàn)lowjo 7.6.1對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、雙色熒光標(biāo)記分析dMΦ兩組在DIC中的占比

采用CD45、CD14標(biāo)記dMΦ，首先對(duì)蛻膜免疫細(xì)胞群“開窗”于CD45+細(xì)胞群(圖1A)，分析其CD14的標(biāo)記情況(圖1B)。流式結(jié)果分析顯示，不明原因自然流產(chǎn)組CD14+dMΦ在DIC中所占比例為(9.9±1.63)%，正常早孕期組CD14+dMΦ在DIC中所占比例為(8.9±0.88)%，兩組差異并無(wú)顯著性(P>0.05)(圖1C)。

A： CD45標(biāo)記dMΦ的流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖；B： CD14標(biāo)記dMΦ的流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖；C：兩組dMΦ在DIC中占比統(tǒng)計(jì)圖圖1 正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組婦女蛻膜單核-巨噬細(xì)胞在蛻膜免疫細(xì)胞群中的占比

二、三色熒光標(biāo)記分析正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組CXCR6+在dMΦ中的表達(dá)情況

圖2是流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖。其中雙陽(yáng)細(xì)胞為CD14+CXCR6+的dMΦ，在正常早孕組及不明原因自然流產(chǎn)組中均有表達(dá)。正常早孕期組中，CD14+CXCR6+在dMΦ的表達(dá)率為(40.0±1.90)%；不明原因自然流產(chǎn)組中，CD14+CXCR6+在dMΦ的表達(dá)率為(31.22±2.38)%，兩組比較差異顯著(P<0.05)。

三、多色熒光流式細(xì)胞術(shù)分析比較兩組蛻膜組織中CD14+CXCR6+/-dMΦ的表型差異

結(jié)果顯示：正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組中，M2型巨噬細(xì)胞表面分子CD206在CD14+CXCR6+dMΦ中表達(dá)率較CD14+CXCR6-dMΦ均顯著增高(P<0.05)，且CD206在正常早孕組CD14+CXCR6+dMΦ和CD14+CXCR6-dMΦ中的表達(dá)均顯著高于不明原因自然流產(chǎn)組(P<0.05)；正常早孕組中，M1型巨噬細(xì)胞表面分子CD80在CD14+CXCR6+dMΦ中表達(dá)率顯著高于CD14+CXCR6-dMΦ(P<0.01)，而自然流產(chǎn)組中，CD80在CD14+CXCR6+dMΦ和CXCR6-dMΦ的表達(dá)率并無(wú)顯著性差異(P>0.05)。正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組相比，CD80在兩組CD14+CXCR6+dMΦ的表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，在正常早孕組CD14+CXCR6-dMΦ中的表達(dá)顯著低于不明原因自然流產(chǎn)組(P<0.01)(圖3)。

A： 兩組CXCR6+在dMΦ中均有表達(dá)流式細(xì)胞分析散點(diǎn)圖；B：CD14+CXCR6+在dMΦ的表達(dá)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；兩組比較，*P<0.05圖2 流式三色熒光標(biāo)記分析正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組CD14+CXCR6+在dMΦ的表達(dá)情況

A：正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組中CD206 在CD14+CXCR6+dMΦ表達(dá)率；B：正常早孕組中CD80在CD14+CXCR6+dMΦ表達(dá)率；兩組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 正常早孕期與不明原因自然流產(chǎn)組CD14+CXCR6+/-dMΦ的表型比較

討 論

正常妊娠的過程中，母胎界面的細(xì)胞免疫即Th1型免疫反應(yīng)下調(diào)，體液免疫即Th2免疫反應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，形成了特殊的免疫耐受環(huán)境，對(duì)于成功妊娠具有重要作用[10]。單核細(xì)胞可從外周遷移到蛻膜局部，分化為巨噬細(xì)胞在蛻膜局部大量聚集，通過與滋養(yǎng)細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相互作用，釋放大量的IL-10、IL-8、PGE2等細(xì)胞因子參與母胎免疫耐受的建立，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化、胚胎的植入和胎盤發(fā)育的全過程[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)比正常早孕組和不明原因自然流產(chǎn)組，dMΦ的數(shù)量并沒有明顯的變化，可能由于單核-巨噬細(xì)胞免疫功能發(fā)生改變，呈現(xiàn)高度易激活狀態(tài)，使母體對(duì)胎兒產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)多種趨化因子及其受體是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要分子，對(duì) Th1/Th2 型細(xì)胞因子的分化、極化及Th1/Th2 型細(xì)胞因子的免疫平衡的調(diào)節(jié)具有重要作用[12]。CXCR6是目前已知趨化因子CXCL16的唯一受體，在本實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于正常早孕期組，不明原因自然流產(chǎn)組蛻膜組織中CXCR6+dMΦ在蛻膜的局部的聚集明顯減少，提示CXCR6+dMΦ可能在維持早孕期的母胎界面正常妊娠中發(fā)揮重要作用。

普遍認(rèn)為，蛻膜免疫細(xì)胞可通過獨(dú)特的表型和分泌大量的細(xì)胞因子參與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲、和分化，從而在母胎界面形成了獨(dú)特的免疫耐受微環(huán)境[13]。在外周血單核細(xì)胞中，80%分化為具有較強(qiáng)抗原提呈功能的經(jīng)典M1型單核-巨噬細(xì)胞，而在正常早孕期母胎界面蛻膜免疫細(xì)胞中單核-巨噬細(xì)胞在可溶性HLA-G5及細(xì)胞因子IL-4、IL-13、IL-10和M-CSF的誘導(dǎo)下更趨向于分化為具有免疫抑制作用的非經(jīng)典M2型巨噬細(xì)胞[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤微缺氧環(huán)境中，CXCR6的表達(dá)水平與組織局部M2型單核細(xì)胞的表達(dá)呈正相關(guān)，CXCL16/CXCR6可介導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞在腫瘤組織中的活性，并且使其更趨向于分化為具有免疫抑制作用的M2型巨噬細(xì)胞，參與腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移[14]。在正常早孕期母胎界面也存在著類似于腫瘤的缺氧微環(huán)境，影響著滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和子宮螺旋動(dòng)脈的生成[15]。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD206在正常早孕期和不明原因自然流產(chǎn)婦女CXCR6+dMΦ中的表達(dá)都要顯著高于CXCR6-dMΦ，這提示在早孕期母胎界面CXCR6可介導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞趨向于分化為M2型巨噬細(xì)胞。同時(shí)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞表面分子CD80在正常早孕期婦女CXCR6+dMΦ中的表達(dá)高于CXCR6-dMΦ，而在不明原因自然流產(chǎn)婦女CXCR6+/-dMΦ的表達(dá)水平無(wú)明顯差異，提示CXCR6與母胎界面促炎性M1型巨噬細(xì)胞在不明原因自然流產(chǎn)中的高度聚集相關(guān)。

由此可見，CXCR6不僅參與募集和吸引母體外周血免疫細(xì)胞到達(dá)并停留于妊娠子宮，還可能對(duì)局部的免疫細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)效應(yīng)，維持M1/M2型巨噬細(xì)胞達(dá)到一定比例的動(dòng)態(tài)平衡。我們實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在不明原因自然流產(chǎn)婦女CXCR6+dMΦ中，M2型巨噬細(xì)胞比例降低，M1型巨噬細(xì)胞在CXCR6-dMΦ中的比例升高，更驗(yàn)證了CXCR6可能參與了早孕期M2型巨噬細(xì)胞在蛻膜組織中的形成和分化及蛻膜局部TH2型免疫偏倚的形成，當(dāng)不明原因自然流產(chǎn)反復(fù)發(fā)生時(shí)，CXCR6的表型和功能特性也會(huì)發(fā)生改變，從而改變母胎界面的免疫微環(huán)境，打破免疫耐受的平衡狀態(tài)。

總之，在不明原因自然流產(chǎn)中，蛻膜單核-巨噬細(xì)胞數(shù)量比例并未發(fā)生明顯變化，CXCR6可能通過介導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞的分化，影響母胎界面免疫耐受，此發(fā)現(xiàn)為預(yù)防和治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)提供了新的思路，但其相關(guān)功能特性，影響機(jī)制和通路還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Xu YY，Wang SC，Li DJ，et al. Co-signaling molecules in maternal-fetal immunity[J]. Trends Mol Med，2017，23：46-58.

[2] 黃煜，李大金，朱影.三色熒光標(biāo)記鑒定早孕蛻膜及外周免疫細(xì)胞組成[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2006，15： 328-332.

[3] Tsai YC，Tseng JT，Wang CY，et al. Medroxyprogesterone acetate drives M2 macrophage differentiation toward a phenotype of decidual macrophage[J]. Mol Cell Endocrinol，2017，452：74-83.

[4] Ning F，Liu H，Lash GE. The role of decidual macrophages during normal and pathological pregnancy[J]. Am J Reprod Immunol，2016，75：298-309.

[5] 唐茂興，廖愛華.單核細(xì)胞亞群與妊娠[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30：717-721.

[6] Houser BL，Tilburgs T，Hill J，et al. Two unique human decidual macrophage populations[J]. J Immunol，2011，186：2633-2642.

[7] Kalish SV，Lyamina SV，Usanova EA，et al. Macrophages reprogrammed in vitro towards the M1 phenotype and activated with LPS extend lifespan of mice with ehrlich ascites carcinoma[J]. Med Sci Monit Basic Res，2015，21：226-234.

[8] Yamaguchi T，F(xiàn)ushida S，Yamamoto Y，et al. Tumor-associated macrophages of the M2 phenotype contribute to progression in gastric cancer with peritoneal dissemination[J]. Gastric Cancer，2016，19：1052-1065.

[9] Huang Y，Zhu XY，Du MR，et al. Human trophoblasts recruited T lymphocytes and monocytes into decidua by secretion of chemokine CXCL16 and interaction with CXCR6 in the first-trimester pregnancy[J]. J Immunol，2008，180：2367-2375.

[10] Piao HL，Tao Y，Zhu R，et al. The CXCL12/CXCR4 axis is involved in the maintenance of Th2 bias at the maternal/fetal interface in early human pregnancy[J]. Cell Mol Immunol，2012，9：423-430.

[11] Svensson-Arvelund J，Mehta RB，Lindau R，et al. The human fetal placenta promotes tolerance against the semiallogeneic fetus by inducing regulatory T cells and homeostatic M2 macrophages[J]. J Immunol，2015，194：1534-1544.

[12] 于潔，黃煜，崔竹梅，等.趨化因子CXCL16對(duì)人早孕蛻膜免疫細(xì)胞的遷移及分泌細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2009，3：235-239.

[13] 朱曉勇，李大金.母胎免疫調(diào)節(jié)機(jī)理的研究進(jìn)展[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2000，9： 56-60.

[14] Cho SW，Kim YA，Sun HJ，et al. CXCL16 signaling mediated macrophage effects on tumor invasion of papillary thyroid carcinoma[J]. Endocr Relat Cancer，2016，23：113-124.

[15] 羅健英，喬福元.缺氧對(duì)細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞MMP9/TIMP1基因表達(dá)及細(xì)胞侵襲力的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，39：216-220.