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    月經(jīng)發(fā)生中低氧誘導(dǎo)因子-1A對VEGF的調(diào)節(jié)

    2018-05-09 05:55:14郭士格南楠尹德東周芳王樹芳劉建兵賀斌王介東徐祥波陳西華
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:蛻膜孕酮月經(jīng)

    郭士格,南楠,尹德東,周芳,王樹芳,劉建兵,賀斌,王介東,徐祥波,陳西華*

    (1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院,北京 100730;2.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所,北京 100081;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,新鄉(xiāng) 453003;4.山西醫(yī)科大學(xué),太原 030001)

    月經(jīng)是女性重要的生理現(xiàn)象,子宮內(nèi)膜異常出血嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量,每年尋求治療的婦女?dāng)?shù)量龐大[1]。但是有關(guān)人類月經(jīng)生理和病理的許多問題仍沒有得到解答。

    Markee[2]將兔的子宮內(nèi)膜移植于雌性獼猴眼前房內(nèi),觀察到蛻膜化的子宮內(nèi)膜在孕酮撤退后,螺旋動脈強(qiáng)烈收縮,推測螺旋動脈收縮引起的組織低氧是造成子宮內(nèi)膜崩解的關(guān)鍵因素。低氧誘導(dǎo)因子HIF1A是應(yīng)答低氧的首要轉(zhuǎn)錄因子[3]。在低氧條件下,HIF1A的降解受到阻斷,HIF1A轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核與HIF1B形成異源二聚體[4],結(jié)合于DNA中的低氧反應(yīng)元件并調(diào)控下游基因表達(dá)。本研究采用的HIF1A抑制劑甲氧雌二醇(Methoxyestradiol,2ME)具有解聚微管蛋白的作用,從而抑制HIF1A進(jìn)入細(xì)胞核[5]。

    血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一個編碼HIF1A轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵應(yīng)答基因[6]。VEGF的所有亞型及其受體均在子宮內(nèi)膜中表達(dá)[7]。VEGF在女性增殖期中期表達(dá)上調(diào)并且促進(jìn)血管增生[8-10]。

    有研究分別利用人子宮內(nèi)膜組織塊、人內(nèi)膜基質(zhì)原代細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),探討了孕酮撤退和低氧對VEGFmRNA的調(diào)節(jié)作用[11-12]。但是在活體內(nèi),孕酮撤退后HIF1A是否直接與VEGF基因的上游啟動子結(jié)合并調(diào)節(jié)其表達(dá),并未明確闡述。本科室前期研究表明[13],小鼠月經(jīng)樣模型崩解期,孕酮撤退后Vegf與Hif1amRNA的表達(dá)變化趨勢隨著時間的推移變化基本一致;HIF1A蛋白進(jìn)入細(xì)胞核,轉(zhuǎn)錄活性被激活,且其達(dá)峰時間點(diǎn)與VegfmRNA達(dá)峰時間點(diǎn)一致。本研究進(jìn)一步以小鼠月經(jīng)樣模型為基礎(chǔ),研究HIF1A對VEGF的調(diào)控作用與調(diào)控關(guān)系,并在小鼠月經(jīng)樣模型中證明HIF1A能夠直接調(diào)控VEGF的表達(dá),并在體外培養(yǎng)模擬月經(jīng)發(fā)生的人蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中得到驗證。

    材料和方法

    一、實驗動物及細(xì)胞材料來源

    實驗動物:8~10周齡C57BL6雌鼠(SPFⅡ),根據(jù)國家衛(wèi)計委科學(xué)技術(shù)研究所動物倫理委員會許可批準(zhǔn)進(jìn)行實驗。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物,光照8:00~20:00,溫度(20±1)℃。

    取術(shù)前三個月未用任何激素藥物給予子宮切除手術(shù)的子宮肌瘤患者增殖中、晚期或分泌早期子宮內(nèi)膜用于人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)。

    二、研究方法

    1.小鼠月經(jīng)樣模型的建立及HIF1A抑制劑干預(yù)實驗:據(jù)前期研究建立小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)樣模型[14]。蛻膜化2 d后移去孕酮皮下埋植管時記為0 h。抑制劑組分別在孕酮撤退前4 h、撤退后4 h與12 h共3個時間點(diǎn)以腹腔注射的方式給予HIF1A抑制劑2ME 100 mg/kg(Selleck,美國);對照組處理為同樣時間給予等量2ME的溶媒溶液。在孕酮撤退后24 h取材,-80°C保存。

    2. 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP):據(jù)ChIP試劑盒(Cell Signaling,美國)操作說明書,取小鼠月經(jīng)樣模型孕酮撤退后0 h、8 h、12 h、16 h和24 h的-80°C凍存小鼠子宮,加入PBS+蛋白酶抑制劑Cocktail(PIC)溶液并剪碎;加入37%甲醛450 μl,室溫?fù)u床孵育20 min進(jìn)行蛋白質(zhì)-DNA交聯(lián)反應(yīng)。隨后加入Glycine終止反應(yīng);樣品達(dá)到單細(xì)胞狀態(tài),依次加入Buffer A/B,加入10~15 μl Micrococcal Nuclease,使樣品DNA被分解成150~900 bp的片段,加入100~150 μl 0.5 mol/L EDTA,終止反應(yīng);破碎細(xì)胞,收集上清完成交聯(lián)染色體制備;用ChIP Buffer將樣品稀釋至100 μg/ml;分別加入沉降抗體:HIF1A 1 μl(1:500)(Novus,美國)、H3陽性對照組蛋白H3抗體10 μl、陰性對照正常兔IgG抗體1 μl,4°C搖床孵育過夜;各樣品加入30 μl ChIP沉降珠,4°C搖床孵育2 h;離心后保留沉淀,隨后沉降珠洗脫,樣品純化,最后利用實時熒光定量PCR檢測目標(biāo)序列的相對含量。

    表1 引物序列

    3.Western blot檢測:-80℃保存的小鼠子宮組織分別提取核蛋白與胞質(zhì)蛋白,加入適量蛋白酶抑制劑;將40~50 μg蛋白質(zhì)進(jìn)行10%SDS-PAGE膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜后,分別進(jìn)行VEGF(Santa Cruz,美國)、HIF1A(Novus,美國)、β-ACTIN(北京康為世紀(jì)生物)、LAMIN-B抗體(Santa Cruz,美國)雜交,用ECL發(fā)光試劑盒(北京全式金生物)檢測。

    4.人蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外模擬月經(jīng)發(fā)生:主要試劑為DMEM/F12(Gibco,美國)、雌二醇(E2)(Alfa Aesar,美國)、甲羥孕酮(MPA)(Sigma,美國)、Charcoal stripped FBS(Invitrogen,美國)。據(jù)前期研究報道建立人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化模型[15],原代培養(yǎng)2 d后,換成維持培養(yǎng)基(無酚紅DMEM/F12+抗生素+MPA 10-7mol/L、E210-8mol/L)培養(yǎng)12~24 h;更換無激素培養(yǎng)基模擬月經(jīng)發(fā)生(DMEM/F12無酚紅+10% Charcoal-stripped FBS+抗生素),記為0 h;在處理后0 h、12 h、24 h和36 h收集細(xì)胞。

    5. 實時熒光定量PCR:將-80℃保存的樣本,TRIzol法提取總RNA。將總RNA與Random primer及Oligo(dT)混合,70℃孵育10 min,迅速于冰上冷卻2~3 min,配制逆轉(zhuǎn)錄體系,30℃孵育10 min,42℃孵育60 min,70℃孵育15 min,最后冰上冷卻,獲得cDNA文庫;用實時熒光定量PCR檢測VEGF和HIF1AmRNA的表達(dá)量。所用主要試劑Real-Time PCR kit(SYBR寶生物工程),引物序列見表1。

    6.人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞HIF1A敲降實驗:敲降組采用激素維持培養(yǎng)基(無酚紅DMEM/F12+2%Charcoal stripped FBS+MPA10-7mol/L、E210-8mol/L)+Hif1a敲降;相應(yīng)的陰性對照組中轉(zhuǎn)染無義序列。無抗生素?zé)o血清激素維持培養(yǎng)基(無酚紅DMEM/F12+MPA10-7mol/L、E210-8mol/L),37°C培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染試劑為LipofectamineTM2000(Thermo Fisher,美國),具體步驟參照產(chǎn)品說明書。轉(zhuǎn)染特異性HIF1A的siRNA序列(Gene Pharma,上海)24 h后完成敲降過程,將培養(yǎng)基更換成無激素培養(yǎng)基模擬月經(jīng)發(fā)生(無酚紅DMEM/F12+2%Charcoal stripped FBS),記為0 h。分別在0、12、24、36 h共4個時間點(diǎn)收集細(xì)胞,Real-time PCR方法檢測VEGFmRNA表達(dá)量。

    四、統(tǒng)計學(xué)方法

    結(jié) 果

    一、HIF1A與Vegf基因在小鼠月經(jīng)樣模型孕酮撤退后的結(jié)合

    孕酮撤退后,ChIP實驗結(jié)果顯示HIF1A結(jié)合Vegfpromoter的相對含量在0 h較低,隨后逐漸上升,在12 h達(dá)到峰值(P<0.01),在16 h迅速降低,24 h隨后略上升,但顯著低于12 h峰值(P<0.01)(圖1)。

    二、小鼠月經(jīng)樣模型中HIF1A抑制劑對HIF1A-VEGF調(diào)控的影響

    圖1 小鼠月經(jīng)樣模型崩解期HIF1A結(jié)合Vegf promoter區(qū)域的相對含量

    在小鼠月經(jīng)樣模型中給予2ME抑制HIF1A功能,于孕酮撤退后24 h檢測HIF1A和VEGF蛋白的表達(dá)。HIF1A在子宮組織細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)在抑制劑組較陰性對照組中高(P<0.01)(圖2A),而胞核中,在抑制劑組中較對照組低(P<0.05)(圖2B)。抑制劑組中VEGF在胞質(zhì)的表達(dá)量較對照組低(P<0.01)(圖2C)。

    A:胞質(zhì)中HIF1A蛋白Western blot結(jié)果與相對表達(dá)量;B:胞核中HIF1A蛋白Western blot結(jié)果及相對表達(dá)量;C:胞質(zhì)中VEGF蛋白Western blot結(jié)果與相對表達(dá)量;相互比較,*P<0.01圖2 小鼠月經(jīng)樣模型中HIF1A抑制劑(2ME)對子宮組織HIF1A-VEGF調(diào)控的影響

    三、HIF1A 與VEGF mRNA在體外模擬月經(jīng)發(fā)生(激素撤退)的人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

    HIF1A與VEGFmRNA均在0 h處于較低水平,12 h略上升;與12 h相比,HIF1AmRNA在24 h、36 h顯著升高(P<0.01),約為12 h的表達(dá)量的3倍,VEGFmRNA的表達(dá)升高更為明顯(P<0.01)(圖3)。

    四、采用siRNA敲降HIF1A對HIF1A-VEGF調(diào)控的影響

    使用HIF1AmRNA特異性siRNA轉(zhuǎn)入蛻膜化人ESC細(xì)胞后,HIF1AmRNA敲降效率在敲降后0 h為90%,在48 h敲降效率為88%(圖4A)。陰性對照組,VEGFmRNA表達(dá)量在激素撤退后呈上升趨勢,在0 h表達(dá)量最低,12 h略上升,在24 h和36 h表達(dá)量顯著高于12 h(P<0.01),且36 h的表達(dá)量進(jìn)一步顯著升高(P<0.01);而HIF1A敲降組,VEGFmRNA的表達(dá)雖略有上升,但是上升的幅度與對照組相比顯著降低(P<0.01),且VEGFmRNA的表達(dá)量在24 h和36 h僅約為陰性對照組的1/2(圖4B)。

    A:HIF1A mRNA的表達(dá);B:VEGF mRNA的表達(dá);相互比較,*P<0.01圖3 孕酮撤退后HIF1A和VEGF mRNA在蛻膜化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)

    A:HIF1A敲降效率;B:陰性對照組與HIF1A敲降組中VEGF mRNA的相對表達(dá)量;相互比較,*P<0.01圖4 HIF1A敲降對于孕酮撤退后蛻膜化人內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響

    討 論

    本研究在小鼠月經(jīng)樣模型中探究HIF1A與VEGF的表達(dá)及其調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示,在孕酮撤退0-24 h,HIF1A結(jié)合的Vegfpromoter的相對含量變化趨勢先升高后降低并在12 h達(dá)到峰值(P<0.05)。VegfmRNA在12 h出現(xiàn)的峰值與此時HIF1A與Vegfpromoter的結(jié)合關(guān)系緊密[13],提示孕酮撤退后HIF1A入核激活,并啟動下游調(diào)控基因VegfmRNA的表達(dá)。2ME抑制HIF1A入核活化的同時,VEGF表達(dá)顯著降低(P<0.05)。綜上證明,小鼠月經(jīng)樣模型在孕酮撤退后HIF1A進(jìn)入細(xì)胞核,其轉(zhuǎn)錄因子功能被激活,并啟動下游調(diào)控基因VegfmRNA的表達(dá)。

    我們進(jìn)一步在體外培養(yǎng)的人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中驗證HIF1A對VEGF的直接調(diào)節(jié)關(guān)系。結(jié)果顯示,HIF1A和VEGFmRNA均在0 h處于較低的水平,在12 h略上升,在24 h、36 h表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。也就是說孕酮撤退顯著上調(diào)HIF1A和VEGFmRNA的表達(dá)量。體外培養(yǎng)的人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞在孕酮撤退后,VEGFmRNA在HIF1A敲降組的表達(dá)雖略有上升,但是上升的幅度與對照組相比顯著降低(P<0.01)。綜上證明,在小鼠月經(jīng)樣模型和體外培養(yǎng)的人蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中,孕酮撤退后HIF1A入核,其轉(zhuǎn)錄因子活性被激活,并啟動下游調(diào)控基因VegfmRNA的表達(dá)。

    低氧誘導(dǎo)因子HIF1A是應(yīng)答低氧的主要轉(zhuǎn)錄因子[3]。2002年Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)HIF1A僅在少數(shù)分泌晚期和月經(jīng)期前的人子宮內(nèi)膜中表達(dá)。2006年,Critchley等[17]發(fā)現(xiàn)HIF1A蛋白和HIF1AmRNA在分泌期功能層人子宮內(nèi)膜,特別是月經(jīng)期人子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá)。低氧條件下,HIF1A的降解被阻斷,HIF1A積累并與HIF1B結(jié)合形成異源二聚體轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi),與基因組中的低氧反應(yīng)元件結(jié)合,調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。血管內(nèi)皮生長因子VEGF是一個編碼HIF1A轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵應(yīng)答基因[6]。本科室前期研究表明,在小鼠月經(jīng)樣模型崩解期,孕酮撤退后VEGF與HIF1AmRNA的表達(dá)量時相變化相一致[13]。

    本研究以小鼠月經(jīng)樣模型為基礎(chǔ),明確了在孕酮撤退后HIF1A轉(zhuǎn)錄因子功能被激活,并直接結(jié)合于Vegfpromoter區(qū),啟動下游調(diào)控基因VegfmRNA的表達(dá)。進(jìn)一步利用人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模擬月經(jīng)發(fā)生(激素撤退),驗證了HIF1A對VEGF的直接調(diào)節(jié)關(guān)系。

    子宮內(nèi)膜異常出血是影響女性生殖健康的重要因素。闡明子宮內(nèi)膜崩解出血生理機(jī)制,有助于促進(jìn)異常出血機(jī)制的研究、治療策略探尋及女性生殖健康水平的提升。

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