肥胖對雄性大鼠生殖功能影響的機制研究

郭穎，王曉尉，周芳，安琪，谷翊群*

(1.國家衛(wèi)生計生委男性生殖健康重點實驗室，國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所，北京 100081；2. 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730)

有調查顯示，我國中老年人群中半數(shù)以上的人處于超重/肥胖狀態(tài)[1]。而肥胖對男性生殖的影響越來越受到關注[2-4]。研究表明，肥胖狀態(tài)往往伴隨著活性氧(ROS)的增加，Bakos等[5]發(fā)現(xiàn)高脂飲食導致大鼠精子DNA碎片化指數(shù)(DFI)增加同時精子活力下降。肥胖狀態(tài)可能通過增加機體氧化損傷水平導致生精障礙，然而目前關于肥胖對精子活力的影響尚未定論[6]。本研究通過高脂飲食構建營養(yǎng)性肥胖的大鼠模型，研究肥胖對雄性大鼠生殖功能的影響，初步探討其氧化損傷相關的機制。

資料與方法

一、研究對象

6周齡SD雄性大鼠45只，體重(130.4±7.2)g，由北京維通利華提供[許可證號：SCXK(京)2012-0001]。

二、方法

1.構建肥胖模型：45只雄性SD大鼠隨機分成對照組(普通飼料)和肥胖組(高脂飲食：普通飼料73%、蔗糖10%、蛋黃粉5%、膽鹽0.5%、膽固醇1.5%、豬油10%)，自由進食飲水，兩組除飲食外其他飼養(yǎng)條件均一致。喂養(yǎng)16周后，測定大鼠體重和身長。

2.肥胖判定標準：目前Lee指數(shù)是評價成年大鼠肥胖的常用數(shù)據(jù)。根據(jù)文獻報道高脂飲食喂養(yǎng)過程中動物可出現(xiàn)肥胖和肥胖抵抗，再結合Lee指數(shù)，本實驗中將肥胖組體重位于后25%位的大鼠去除[7]。因此，最終得到對照組(n=15)和肥胖組(n=22)。

3.計算身體指數(shù)：腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)，麻醉后取材。稱取內臟脂肪、雙側睪丸和附睪的重量。計算相關參數(shù)：Lee指數(shù)=[體重(g)×103/身長(cm)]1/3；脂肪、睪丸和腎臟系數(shù)=器官重量/體重×100%。

4.代謝和內分泌指標測定：腹主動脈取血，4℃、2 400 r/min離心20 min分離血清，-80℃凍存。由酶聯(lián)免疫法(上海瀘峰化工)和放射免疫法(北京北方生物)測定，具體方法過程根據(jù)試劑盒中說明書操作，其中代謝指標包括葡萄糖(GLU)、胰島素(INS)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、瘦素(Lep)，內分泌指標包括促性腺激素釋放激素GnRH、LH、FSH、總睪酮(TT)、雌二醇(E2)、性激素結合球蛋白(SHBG)。依據(jù)公式計算：游離睪酮指數(shù)(FTI)=T/SHBG、睪酮分泌指數(shù)(TSI)=LH/T、游離睪酮(cFT)=[T-23.43cFT/SHBG-(T-23.43cFT)]×10-9mol/L。

5.精子參數(shù)：附睪尾經(jīng)37℃生理鹽水簡單洗滌，置于2 ml凍存管中剪碎再加入精子洗滌液中，37℃水浴箱中輕微震蕩孵育30 min。計算機輔助精子分析系統(tǒng)(CASS)計數(shù)精子濃度、活力和前向運動。

6.生精細胞凋亡檢測：取大鼠睪丸，Bouins液固定、石蠟包埋后切片。依據(jù)試劑盒(羅氏，美國)操作說明測定睪丸組織生精細胞的凋亡情況，光學顯微鏡下觀察至少5個視野，計數(shù)500個生精細胞。凋亡細胞指數(shù)(AI)=凋亡細胞數(shù)/500×100%。

7.睪丸組織氧化應激檢測：用玻璃勻漿管制作睪丸組織勻漿液，冰上進行。4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，考馬斯亮藍染色測定總蛋白濃度。參照試劑盒(南京建成生物)說明測定超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)濃度。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、兩組大鼠身體指標和代謝參數(shù)比較

喂養(yǎng)16周后，肥胖組大鼠體重、Lee指數(shù)、脂肪系數(shù)顯著升高而睪丸系數(shù)、腎臟系數(shù)顯著降低，血清中Lep、INS、TG顯著升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組大鼠的身長、GLU和TC無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、兩組大鼠生殖內分泌激素結果比較

統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，肥胖組大鼠GnRH、LH、TT、SHBG顯著降低而E2顯著升高，經(jīng)公式計算的FTI、cFT差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組大鼠血清FSH未見顯著性差異(P>0.05)(表2)。

三、兩組大鼠附睪尾精子計數(shù)

統(tǒng)計結果顯示，與對照組比較，肥胖組大鼠附睪尾精子活力和前向運動精子百分比顯著下降(P<0.01)；兩組大鼠的精子濃度無明顯差異(P>0.05)(表3)。

四、睪丸生精細胞凋亡與氧化應激的檢測

TUNEL法檢測肥胖組大鼠生精細胞凋亡指數(shù)較對照組顯著增加(P<0.05)，肥胖組大鼠睪丸組織勻漿MDA濃度顯著升高而SOD活力顯著降低(P<0.05)(表4)。

表1 一般身體指標和代謝參數(shù)(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

表2 生殖-內分泌激素檢測結果(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

表3 兩組精子參數(shù)的比較(-±s)

注：與對照組比較，*P<0.01

表4 兩組AI、MDA和SOD比較(-±s)

注：MDA、SOD單位：每毫克蛋白的濃度、活力；與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

討 論

目前，肥胖對男性生殖的影響尚無定論。一項回顧性分析發(fā)現(xiàn)約1/3的文章報道肥胖會導致精子活力和精子濃度的下降[6]。近期也有學者發(fā)現(xiàn)，超重或者肥胖是男性少精子癥、無精子癥的高危因素[8-9]。鑒于人群中的研究容易受到其他因素(如生活習慣、藥物使用等)的干擾，因此本研究采用模式生物SD雄性大鼠為研究對象，條件可控。

本項研究的基礎是營養(yǎng)性肥胖大鼠模型的建立，與對照組相比，高脂飲食誘導大鼠的體重和Lee指數(shù)明顯增加，說明肥胖模型造模成功。另外內臟脂肪也是判斷肥胖的重要體質指標，實驗中測定兩組大鼠腸系膜、腎周和睪周脂肪在內的總脂肪重量及脂肪系數(shù)，高脂飲食組明顯高于普通飲食組。瘦素是由脂肪細胞分泌的抑制肥胖的一種蛋白，但是處于肥胖狀態(tài)時，機體不僅降低對自身瘦素的反應，并對外源瘦素產(chǎn)生抗性[10]。此外，脂質代謝紊亂也與肥胖關系密切。本研究中，肥胖組大鼠出現(xiàn)了高瘦素、高胰島素和高甘油三脂，說明肥胖大鼠出現(xiàn)瘦素抵抗和代謝紊亂。

有數(shù)據(jù)表明，雄激素低下與體重升高有一定的關聯(lián)，而嚴重肥胖可能導致機體下丘腦-垂體-性腺軸功能的紊亂[11]。一項生物信息學的研究結果顯示，肥胖狀態(tài)下機體生殖功能受到影響可能與類固醇激素、肽類激素代謝改變有重要關系[12]。睪酮是精子發(fā)生的關鍵激素，睪酮合成受LH激活的cAMP/PKA通路的調控，本實驗中睪酮水平的降低并伴隨著GnRH和LH的下降，我們推測肥胖抑制了HPT的整個通路。此外，肥胖狀態(tài)下脂肪細胞產(chǎn)生過多的芳香化酶，從而導致睪酮轉化E2增多，而E2的增加進一步抑制HPT軸，進一步抑制睪酮的合成和分泌。再者血清學分析顯示肥胖組大鼠SHBG水平顯著低于正常組大鼠，而性激素結合球蛋白(SHBG)在雄激素運輸過程中發(fā)揮著重要的保護作用，這可能也是肥胖組大鼠睪酮低的原因之一。

細胞凋亡是機體生長發(fā)育中正常的生理性死亡現(xiàn)象，正常大鼠睪丸中也存在著自發(fā)的生精細胞凋亡現(xiàn)象。Kun等[13]研究顯示促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2通過線粒體途徑在調控生精細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，二者比例失調可以激活下游caspase信號通路。細胞凋亡的顯著特點之一就是DNA碎片化，本研究采用TUNEL檢測睪丸組織生精細胞DNA損傷，結果顯示高脂飲食大鼠生精細胞凋亡指數(shù)較對照組明顯增高，可能通過線粒體通路導致的生精細胞凋亡從而造成男性不育。

肥胖患者常伴隨ROS的增加[14]，氧化應激水平升高與多種因素相關，其中線粒體功能改變起決定作用。在能量攝入過多的情況下導致機體高血糖水平使線粒體呼吸鏈活性增強，ROS增多。在正常生理條件下，氧化應激處于動態(tài)平衡，當機體受到損傷時，其活性氧(ROS)就會增加，從而造成精子損傷[15]。精子膜富含多聚不飽和脂肪酸且抗氧化酶水平相對較低，容易受到活性氧的攻擊影響精子膜結構。另外過多的ROS也會攻擊精子線粒體DNA，使精子線粒體功能受損，從而導致精子運動能力的下降。本研究中高脂飲食的大鼠睪丸組織勻漿中SOD降低而MDA升高，說明肥胖組大鼠氧化應激水平提高。這可能是本實驗中肥胖組精子活力和前向運動精子百分比明顯下降的原因。此外，肥胖組大鼠的睪酮水平低下，而睪酮作為精子發(fā)生成熟的關鍵因素，也可能導致精子活力下降。另外也有研究顯示，高血脂水平可使附睪發(fā)生退行性的改[16]，高胰島素血癥和瘦素水平升高會引起精子線粒體功能受損，從而使精子活力下降[17-20]。由此可見，本研究中肥胖組大鼠精子活力下降與前述的代謝紊亂亦密切相關。

綜上所述，本研究中高脂飲食誘導的肥胖大鼠出現(xiàn)代謝紊亂，下丘腦-垂體-睪丸性腺軸受到抑制，加之氧化損傷的增加導致生精細胞凋亡和精子活力下降。

致謝特別感謝中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院葛爭艷教授在構建肥胖大鼠模型中的悉心指導。

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