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    利用鼠胚實(shí)驗(yàn)對(duì)新建人類輔助生殖實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量控制分析

    2018-05-09 05:55:17屈春鳳莫鳳明蔣軍松韋福慶韋海燕
    生殖醫(yī)學(xué)雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:卵裂體外受精囊胚

    屈春鳳,莫鳳明,蔣軍松,韋福慶,韋海燕

    (廣西河池市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,河池 547000)

    體外受精-胚胎移植(IVF-ET)是一項(xiàng)有效治療不孕不育的人類輔助生殖技術(shù)(ART),而IVF實(shí)驗(yàn)室好比一座加工廠,對(duì)IVF結(jié)局有著極為重要的影響[1]。相對(duì)于體內(nèi),體外培養(yǎng)的配子/胚胎脫離了母體自身保護(hù),不具備任何保護(hù)屏障,對(duì)體外微環(huán)境的變化非常敏感,有可能會(huì)影響其發(fā)育潛能。因此,在輔助生殖全過程中需要有嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制系統(tǒng)與質(zhì)量保障系統(tǒng)為配子和胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的場(chǎng)所。那么,對(duì)于新建IVF實(shí)驗(yàn)室在啟用前,更應(yīng)該全方位地監(jiān)督和檢測(cè)各個(gè)環(huán)節(jié),以建立穩(wěn)定、可靠的培養(yǎng)體系,保證胚胎的質(zhì)量。鼠胚實(shí)驗(yàn)(mouse embryo assay,MEA)是目前最常用于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)液、耗材及設(shè)備質(zhì)量控制的生物檢測(cè)方法,適用于新建或新啟動(dòng)周期的IVF實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制[2]。我院IVF胚胎實(shí)驗(yàn)室于2016年初建成,啟用前對(duì)其進(jìn)行了為期1個(gè)月的“熱處理”[3]后,自6月至11月,在新實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下,我們利用昆明系小白鼠行體內(nèi)外受精及胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)控評(píng)估,為開展人類胚胎體外培養(yǎng)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及質(zhì)量保障。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)情況報(bào)道如下。

    一、材料與方法

    1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6周齡雌性昆明系小白鼠、8周齡以上雄性昆明系小白鼠,均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在控光(白天光照12 h,夜間黑暗12 h)、控溫(20~25℃)條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后方用于實(shí)驗(yàn)。

    2. 試劑與設(shè)備:取胚胎處理液G-MOPS、洗精受精液G-IVF、卵裂胚培養(yǎng)液G1、囊胚培養(yǎng)液G2、人血清白蛋白HAS、石蠟油,均為瑞典Vitrolife 公司產(chǎn)品;Labotect CO2培養(yǎng)箱(德國(guó));K-SYSTEMS三氣培養(yǎng)箱(丹麥);NIKON 解剖顯微鏡、NIKON 倒置顯微鏡(日本);K-SYSTEMS IVF工作站(丹麥);Labotect CO2濃度檢測(cè)儀(德國(guó))等。

    3. 小鼠超排卵[4]:將注射用血促性素(PMSG)和注射用絨促性素(HCG,均購(gòu)自杭州動(dòng)物藥品廠)配制成100 U/ml的溶液,分裝保存于-20℃。培養(yǎng)液均于使用前一天下午配制好后置于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱過夜平衡,G-MOPS置于37℃恒溫箱平衡。雌鼠腹腔內(nèi)注射PMSG 10 U/只,48 h后再腹腔內(nèi)注射HCG 10 U/只。

    4. 體外受精實(shí)驗(yàn):(1)卵母細(xì)胞的采集:HCG后15~16 h采用頸椎脫臼法處死雌鼠,無菌條件下取出輸卵管,于G-MOPS+10%HAS中沖洗3次,用1 ml注射器于體視鏡下輕輕刺破輸卵管膨大部使卵子團(tuán)釋放出來,將其收集并轉(zhuǎn)移至G-IVF受精液中,于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待授精。(2)精子的采集與獲能:采用頸椎脫臼法處死雄鼠,無菌條件下取出附睪尾,于G-MOPS+10%HAS中沖洗3次,用眼科鑷輕輕擠出精子,收集精子懸液加入裝有G-IVF液的試管底部,置于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱中上游并獲能30~60 min。(3)體外受精與培養(yǎng):收集獲能后上層精子于另一試管中,顯微鏡下觀察其活力及濃度,取適量精子懸液加入含有卵子團(tuán)的G-IVF液中,使其終濃度約為1.5×106/ml,置于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),授精4 h后將卵子移至另一含G-IVF液受精皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

    5. 體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn):HCG后將雌雄小鼠按1∶1合籠,次日早上觀察雌鼠是否見陰栓。觀察到陰栓的雌鼠以頸椎脫臼法處死,無菌條件下取出輸卵管,于G-MOPS+10%HAS中沖洗3次,用1 ml注射器于體視鏡下輕輕刺破輸卵管膨大部使合子釋放出,將其收集并轉(zhuǎn)移至G-IVF受精液中,于37℃、含6%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    6. 原核及卵裂期胚胎的觀察與培養(yǎng)(圖1):D0:下午原核觀察;D1:上午2細(xì)胞期胚胎觀察,并將其轉(zhuǎn)至已過夜平衡的卵裂胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng);D2:上午4細(xì)胞期胚胎觀察,下午8細(xì)胞期胚胎觀察,并轉(zhuǎn)至已過夜平衡的囊胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng);D3:上午桑椹期胚胎觀察;D4:上午早期囊胚觀察;D5~D6:上午囊胚觀察。

    7. 數(shù)據(jù)分析:采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    二、結(jié)果

    1. 體外受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果:共進(jìn)行了25個(gè)體外受精周期實(shí)驗(yàn),總獲卵1 023個(gè),其中原核受精胚共823個(gè),受精率為80.4%,卵裂率為95.1%,2-細(xì)胞囊胚形成率為77.1%(表1)。

    表1 昆明系小白鼠體外受精及胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    A:合子;B:2-細(xì)胞胚胎;C:4-細(xì)胞胚胎;D:8-細(xì)胞胚胎;E:桑葚胚;F:囊胚圖1 不同發(fā)育階段的小鼠胚胎(×10)

    2.體內(nèi)受精實(shí)驗(yàn)結(jié)果:共進(jìn)行了17個(gè)體內(nèi)受精周期實(shí)驗(yàn),共獲卵642個(gè),其中原核受精胚513個(gè),受精率79.9%,卵裂率為97.1%,2-細(xì)胞囊胚形成率為80.9%(表2)。

    3.兩組實(shí)驗(yàn)小鼠胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果比較:體內(nèi)受精組與體外受精組相比,其受精率、卵裂率及2-細(xì)胞囊胚形成率兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

    表2 昆明系小白鼠體內(nèi)受精及胚胎培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    表3 兩組實(shí)驗(yàn)小鼠胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果比較(%)

    三、討論

    輔助生殖技術(shù)與其他學(xué)科最大的區(qū)別在于其對(duì)胚胎實(shí)驗(yàn)室的依賴性和協(xié)同性。因此,胚胎實(shí)驗(yàn)室是ART實(shí)施的重要支撐點(diǎn),是保證ART成功的重要核心條件。實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制系統(tǒng)不僅能確保結(jié)果的穩(wěn)定性,而且還可追蹤實(shí)驗(yàn)室操作事件[5]。胚胎體外受精與培養(yǎng)是一種人工模擬輸卵管、子宮環(huán)境的過程,所有直接或間接接觸配子和胚胎的用品及環(huán)境,如溫度、濕度、CO2濃度、pH、滲透壓、離子濃度、塵埃、揮發(fā)性有機(jī)物(VOC)等均有可能存在危害胚胎的因素[6-7]。目前,MEA是評(píng)估IVF實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)體系最為廣泛應(yīng)用的方法,不僅能夠反映胚胎的發(fā)育潛能,同時(shí)還能監(jiān)測(cè)胚胎實(shí)驗(yàn)室整體的培養(yǎng)環(huán)境條件及操作技能,如空氣質(zhì)量、溫濕度、培養(yǎng)液、耗材、培養(yǎng)箱、氣體以及技術(shù)人員操作水平等[8-9]。

    本研究利用昆明系小白鼠行體內(nèi)、體外受精兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),對(duì)本中心新建的輔助生殖實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)系統(tǒng)及技術(shù)員操作水平進(jìn)行了全面的質(zhì)量控制。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,無論是小鼠體內(nèi)或體外獲得的原核受精胚,皆能在體外培養(yǎng)發(fā)育至囊胚階段,胚胎發(fā)育狀況良好,且受精率(79.9% vs. 80.4%)、卵裂率(97.1% vs. 95.1%)、2-細(xì)胞囊胚形成率(80.9% vs. 77.1%)相比較,兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其囊胚率比國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]的偏低,但各項(xiàng)指標(biāo)均符合人類輔助生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[2,12-13]。以上結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)體系以及技術(shù)人員的操作水平已合格,能夠繼續(xù)開展人類IVF技術(shù)項(xiàng)目。

    在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,會(huì)有多種因素影響到胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育。從表1、表2可見,前兩個(gè)批次周期的受精率和囊胚形成率低,波動(dòng)較大。分析其原因可能是:(1)實(shí)驗(yàn)初期,技術(shù)人員操作技術(shù)不夠熟練,體外操作時(shí)間過長(zhǎng),導(dǎo)致培養(yǎng)液溫度、滲透壓等改變,進(jìn)而影響了后續(xù)胚胎發(fā)育;(2)熱臺(tái)溫度設(shè)置時(shí)欠考慮培養(yǎng)皿熱傳導(dǎo)和熱丟失,造成溫度波動(dòng),可能導(dǎo)致了胚胎不可逆的損傷。溫度對(duì)卵子的影響是顯而易見的,溫度的變化會(huì)影響卵子內(nèi)部一些結(jié)構(gòu)的變化,其主要影響紡錘體的形態(tài)。有學(xué)者通過對(duì)加溫裝置的改進(jìn)發(fā)現(xiàn),若微滴內(nèi)溫度保持在37℃,在更多的卵子內(nèi)會(huì)觀察到紡錘體的存在,并且可顯著提高受精率和懷孕率;(3) 觀察的時(shí)間和次數(shù)增加,導(dǎo)致卵子和胚胎體外曝光的時(shí)間延長(zhǎng)。相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn),輔助生殖中光照影響早期胚胎發(fā)育[14]。針對(duì)發(fā)現(xiàn)的問題,我們及時(shí)地進(jìn)行了糾正,隨著操作技術(shù)的不斷嫻熟,后續(xù)實(shí)驗(yàn)的受精率、卵裂率及囊胚形成率也在提高。但在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),同批次小鼠,同樣的培養(yǎng)環(huán)境,同樣批號(hào)的試劑、促排藥物等,同樣的操作技術(shù),其實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)波動(dòng),考慮到胚胎體外受精及培養(yǎng)受諸多因素的影響,其可能與精子及卵子的質(zhì)量有關(guān),或者與雌鼠的發(fā)情周期有關(guān)[15],隨著周齡增長(zhǎng)雌雄小鼠的配子質(zhì)量亦會(huì)下降,尤其是雌鼠對(duì)促排的效果明顯降低,因此在實(shí)驗(yàn)中,我們盡量使用適齡的雌雄小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以期達(dá)到理想的效果。

    通過鼠胚實(shí)驗(yàn),我們技術(shù)人員的操作水平及熟練程度得到了很大的鍛煉和提高,但在保證實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度以及操作章程符合要求的情況下,一些細(xì)微之處也不容忽視。在實(shí)驗(yàn)中我們注意到,培養(yǎng)箱的打開時(shí)間和次數(shù)也會(huì)影響到囊胚形成率,這與相關(guān)研究[16]一致。因此,在今后工作中,需謹(jǐn)慎對(duì)待每一項(xiàng)操作規(guī)程,不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn),提升技術(shù),保證人類IVF技術(shù)實(shí)施的可靠性與穩(wěn)定性。

    總之,對(duì)于新建或新啟動(dòng)周期的IVF實(shí)驗(yàn)室,為了保證培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)系統(tǒng)的可靠性,利用鼠胚實(shí)驗(yàn)對(duì)影響配子受精及胚胎發(fā)育的因素進(jìn)行質(zhì)量控制是有必要的。

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