鐮刀菌毒素和改性蒙脫石吸附劑對全價(jià)飼糧發(fā)酵參數(shù)的影響

劉艷君 姜新超 李會(huì)榮 馮 蕾 楊在賓 楊維仁 姜淑貞 李祥明(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 708)(中慧農(nóng)牧股份有限公司昌樂分公司，濰坊 6400)(山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南 500)

霉菌毒素是由霉菌產(chǎn)生的一類次生有毒代謝產(chǎn)物，其中的曲霉菌屬、鐮刀菌屬和青霉菌屬是產(chǎn)生毒素的最主要的霉菌[1]。鐮刀菌可分泌多種毒素，主要是玉米赤霉烯酮、單端孢霉毒素、伏馬毒素和嘔吐毒素等[2]，是污染糧食的主要產(chǎn)毒霉菌之一，對畜禽的危害尤為嚴(yán)重[3]。隨著我國養(yǎng)殖和飼料行業(yè)的迅速發(fā)展，利用微生物發(fā)酵技術(shù)來改善原料和飼料的營養(yǎng)價(jià)值，降解原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料利用率，改善動(dòng)物生產(chǎn)水平，是我國飼料工業(yè)的重點(diǎn)發(fā)展方向之一[4-5]。研究表明，混菌發(fā)酵霉變?nèi)珒r(jià)飼料，24 h后pH呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，隨著發(fā)酵深入，最終基本維持在平穩(wěn)的水平[6]。利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵母豬全價(jià)配合飼料，粗灰分含量與對照組相比有所提高[7]，因此，發(fā)酵后使OM的含量降低。不同乳酸菌劑發(fā)酵全混合日糧，在各時(shí)間點(diǎn)NH3-N含量穩(wěn)步上升[8]。在全株玉米青貯中添加不同類型的乳酸菌制劑pH顯著降低，同時(shí)提高了乳酸含量[9]。國內(nèi)外有關(guān)飼糧發(fā)酵研究主要集中在發(fā)酵改善常規(guī)飼料和原料的營養(yǎng)價(jià)值、降解原料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，鮮見飼糧發(fā)酵對鐮刀菌毒素污染飼糧添加改性蒙脫石吸附劑的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究復(fù)合菌種(乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌分別為6.33×106、1.05×106、8.94×106cfu/g)發(fā)酵對鐮刀菌毒素飼糧pH、OM、NH3-N和乳酸含量的影響，同時(shí)評價(jià)改性蒙脫石吸附劑對鐮刀菌毒素飼糧發(fā)酵參數(shù)的影響，為生產(chǎn)中霉變飼料的處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

發(fā)酵菌種：乳酸菌(Lactobacillus)，5×109cfu/g；酵母菌(Yeast)，4.6×109cfu/g，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，1.9×1010cfu/g：北京科為博生物科技有限公司。

吸附劑(Calibrin-A，CA)，為焙燒改性蒙脫石吸附劑：美國Oil-Dri公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分6個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9桶。對照組(Contr.)為基礎(chǔ)飼糧，實(shí)驗(yàn)1(25 Myco.)和2組(50 Myco.)分別用25%和50%的發(fā)霉玉米和發(fā)霉玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)飼糧中的玉米和玉米蛋白粉，實(shí)驗(yàn)3(Contr.+CA)、4(25 Myco.+CA)和5(50 Myco.+CA)組分別在基礎(chǔ)飼糧、實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)2組的基礎(chǔ)上添加0.2%的CA。

1.3 實(shí)驗(yàn)飼糧與實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)飼糧的配制

斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧(Contr.)參考美國NRC(1998)營養(yǎng)需要配制，用發(fā)霉的玉米和玉米蛋白粉代替基礎(chǔ)飼糧中的玉米和玉米蛋白粉配制成含有100%霉變飼糧，隨后用100%霉變的鐮刀菌毒素飼糧和對照飼糧按照1:3配制成25 Myco.飼糧，用100%霉變的鐮刀菌毒素飼糧和對照飼糧按照1:1配制成50 Myco.飼糧。分別將Contr.、25 Myco.和50 Myco.飼糧與0.2%的CA混合均勻得到Contr.+CA、25 Myco.+CA和50 Myco.+CA飼糧。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。飼糧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)開始前將一定比例發(fā)酵菌種(乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌分別為6.33×106、1.05×106、8.94×106cfu/g)配制成水溶液，均勻噴灑在所有實(shí)驗(yàn)飼糧中，然后噴灑蒸餾水調(diào)節(jié)飼糧含水量至50%，攪拌均勻，裝入塑料桶(50±0.36) kg，密封發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在16～18 ℃。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))/%

注：1)每千克飼糧提供：VA 3 300 IU；VD3330 IU；VE 24 IU；VK30.75 mg；VB11.50 mg；VB25.25 mg；VB62.25 mg；VB120.026 mg；泛酸15.00 mg；尼克酸22.5 mg；生物素0.075 mg；葉酸0.45 mg；錳6.00 mg；鐵150 mg；鋅150 mg；銅9.00 mg；碘0.21 mg；硒0.45 mg。2)粗蛋白、鈣和總磷為實(shí)測值，其他營養(yǎng)水平為設(shè)計(jì)值。

1.4 樣品的采集與制備

飼糧密封前采樣作為第0天的樣品，然后分別于飼糧發(fā)酵的第6天(每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇3桶，采樣完畢棄去)、第12天(每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇3桶，采樣完畢棄去)和第18天(每個(gè)重復(fù)剩余的3桶)采集樣品。采樣方法：距離桶邊約20 cm做一個(gè)圓，在圓上劃一個(gè)“十”字，“十”字與圓的4個(gè)交點(diǎn)和圓心作為取樣點(diǎn)；分別在距離發(fā)酵桶上表面約20 cm處、桶底約20 cm處和桶的中央采樣，每個(gè)采樣點(diǎn)采樣約500 g，然后將每個(gè)桶的上、中、下15個(gè)點(diǎn)的樣品混合，立即測定pH。按照四分法縮樣，最后將樣品平均分成2份(每份約500 g)，一份置于60 ℃烘箱中制成風(fēng)干樣，粉碎用于OM含量測定，另一份置于-20 ℃保存，用于NH3-N和乳酸含量測定。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 飼糧中霉菌毒素的檢測

采用免疫親和柱層析凈化，以液相色譜法熒光檢測器測定玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的含量，外標(biāo)法定量。采用免疫親和層析凈化高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以液相色譜結(jié)合紫外檢測器測定伏馬毒素B1和B2、T-2毒素和嘔吐毒素的含量，外標(biāo)法定量。玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、T-2毒素和嘔吐毒素的最低檢測限為分別為0.1 mg/kg、1.0 μg/kg、0.5 μg/kg、0.25 mg/kg、0.02 μg/kg和0.1 mg/kg，實(shí)驗(yàn)各組霉菌毒素含量見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)各組鐮刀菌毒素含量

1.5.2 pH測定

飼料中pH值測定采用Raclecki(1988)推薦的方法：稱取20 g發(fā)酵飼料放入燒杯中加入40 mL去離子水，用玻璃棒攪拌均勻，形成漿狀液，用pH計(jì)(便攜式酸度計(jì)PHB-1，杭州齊威儀器有限公司)測定其pH值。

1.5.3 OM測定

參照GB/T 6438—2007粗灰分測定方法操作，OM=飼糧-粗灰分。

1.5.4 NH3-N測定

采用靛酚藍(lán)比色法[10]，在強(qiáng)堿性介質(zhì)中，氨與苯酚和次氯酸鈉反應(yīng)生成靛酚藍(lán)，在以氨標(biāo)準(zhǔn)溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用分光光度計(jì)在625 nm下測定吸光度。

1.5.5 乳酸測定

乳酸(LD)測試盒(A019-2):南京建成生物工程研究所(南京)，具體處理和測定方法均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用雙因素方差分析和三因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Duncan’s多重比較，顯著性水平為P<0.05。通過SPSS 17.0分析發(fā)酵各參數(shù)間皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對pH的影響

飼糧pH隨發(fā)酵時(shí)間呈下降趨勢(表3，P<0.05)，發(fā)酵到第12天基本穩(wěn)定，所有處理第12和18天的pH差異不顯著(P>0.05)。添加CA沒有影響各時(shí)間點(diǎn)的pH(P>0.05)；但是與不添加CA相比，添加CA的全程平均pH顯著降低(P=0.018)。毒素水平顯著影響發(fā)酵0、12和18 d的pH(P<0.05)，發(fā)酵第0天時(shí)，對照組pH顯著高于25%毒素組(P<0.05)，25%毒素組又顯著高于50%毒素組(P<0.05)；發(fā)酵12 d和18 d，對照組pH則顯著低于25%和50%毒素組(P<0.05)，而25%毒素組和50%毒素組差異不顯著(P>0.05)。對照組發(fā)酵全程平均pH顯著高于25%毒素組(P<0.05)，25%毒素組又顯著高于50%毒素組(P<0.05)。發(fā)酵第0天，CA和鐮刀菌毒素具有顯著的交互作用(P<0.05)。

表3 發(fā)酵對飼糧pH的影響

注：同行肩注不同大寫字母者，差異顯著(P<0.05)，同列肩注不同小寫字母者，差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 對OM的影響

飼糧OM隨發(fā)酵時(shí)間呈下降趨勢(表4，P<0.05)，發(fā)酵到第6天基本穩(wěn)定，所有處理第6、12和18天的pH差異不顯著(P>0.05)。添加CA沒有影響各時(shí)間點(diǎn)和全程的平均OM(P>0.05)。毒素水平?jīng)]有影響各時(shí)間點(diǎn)的平均OM(P>0.05)；但是對照組發(fā)酵全程平均OM顯著低于50%毒素組(P=0.044)。CA和鐮刀菌毒素對發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)和全程的平均OM均沒有顯著的交互作用(P>0.05)。

2.3 對NH3-N的影響

飼糧NH3-N隨發(fā)酵時(shí)間呈上升趨勢(表5，P<0.05)。添加CA沒有影響各時(shí)間點(diǎn)和全程的平均NH3-N(P>0.05)。毒素水平顯著影響發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)的NH3-N(P<0.05)，發(fā)酵第0天時(shí)，50%毒素組NH3-N含量顯著低于25%毒素組(P<0.05)，25%毒素組NH3-N含量又顯著低于對照組(P<0.05)；發(fā)酵第6、12和18天，對照組NH3-N含量顯著低于25%和50%毒素組(P<0.05)，而25%毒素組和50%毒素組差異不顯著(P>0.05)。對照組發(fā)酵全程的平均NH3-N顯著低于25%毒素組和50%毒素組(P<0.05)。CA和鐮刀菌毒素對發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)和全程的平均NH3-N均沒有顯著的交互作用(P>0.05)。

2.4 對乳酸的影響

飼糧乳酸隨發(fā)酵時(shí)間呈上升趨勢(表6，P<0.05)，發(fā)酵到第12天基本穩(wěn)定。添加CA沒有影響各時(shí)間點(diǎn)和全程的平均乳酸含量(P>0.05)。毒素水平顯著影響發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)的乳酸(P<0.05)，整個(gè)發(fā)酵過程中，對照組乳酸含量顯著高于25%毒素組(P<0.05)，而25%毒素組乳酸含量又顯著高于50%毒素組(P<0.05)。對照組發(fā)酵全程的平均乳酸含量顯著高于25%毒素組(P<0.05)，而25%毒素組乳酸含量又顯著高于50%毒素組(P<0.05)。發(fā)酵0 d和12 d，CA和鐮刀菌毒素具有顯著的交互作用(P<0.05)。

表4 發(fā)酵對飼糧OM的影響/%

表5 發(fā)酵對飼糧NH3-N的影響/mg/g

表6 發(fā)酵對飼糧乳酸的影響/mmol/g

2.5 相關(guān)性分析

飼糧發(fā)酵各參數(shù)之間相關(guān)系數(shù)見表7。pH與OM呈顯著正相關(guān)(P=0.028)，而與NH3-N(P=0.044)和乳酸(P=0.007)呈顯著負(fù)相關(guān)。OM與NH3-N呈顯著正相關(guān)(P=0.004)，而與乳酸呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.018)。NH3-N和乳酸存在顯著的正相關(guān)(P=0.022)。

表7 發(fā)酵參數(shù)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)

3 討論

關(guān)于全價(jià)飼糧發(fā)酵的研究，有些發(fā)酵全價(jià)飼糧[11]，有些則發(fā)酵原料[12]，但自然霉變的飼糧添加改性蒙脫石吸附劑的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)尚鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)飼料選擇只含有鐮刀菌毒素的自然霉變的玉米和玉米蛋白粉，因此，可以用于研究鐮刀菌毒素和改性蒙脫石吸附劑對全價(jià)飼糧發(fā)酵參數(shù)的影響。

3.1 鐮刀菌毒素對全價(jià)飼料發(fā)酵pH的影響

pH能綜合地反映出發(fā)酵的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵初期，隨著毒素含量升高，飼料中的pH逐漸降低，推測原因可能是串珠鐮刀菌毒素通常以鈉鹽和鉀鹽形式存在的，其游離酸為強(qiáng)酸，pKa為0.0±0.05～1.7，化學(xué)性質(zhì)屬于半方酸陰離子，與無機(jī)酸性質(zhì)類似[13-14]。李永凱等[15]表明：乳酸菌是一類能發(fā)酵可利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌。李紹章[16]等實(shí)驗(yàn)也證明了發(fā)酵飼料中乳酸的含量變化與pH值的變化規(guī)律一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)酵末期對照組pH(<4.5)達(dá)到良好飼料標(biāo)準(zhǔn)[17-18]。而鐮刀菌生長消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，致使發(fā)酵過程中產(chǎn)酸能力相對降低[19-20]，因而造成毒素組pH較高(4.57～4.63)。

3.2 鐮刀菌毒素對全價(jià)飼料發(fā)酵OM的影響

有機(jī)化合物含量是鑒別發(fā)酵飼料品質(zhì)的常用指標(biāo)之一[21]。楊旭等[22]采用固體發(fā)酵研究發(fā)酵對豆粕養(yǎng)分的影響表明，發(fā)酵后OM含量降低。高白茹等[23]也證明秸稈和秸稈殘?jiān)?jīng)過厭氧發(fā)酵后OM含量降低，與本實(shí)驗(yàn)的研究一致。但OM降低程度各不相同，這與發(fā)酵底物、發(fā)酵菌種和發(fā)酵溫度有關(guān)。盡管本研究毒素水平?jīng)]有顯著影響各時(shí)間點(diǎn)的平均OM，但是與發(fā)酵初始(0 d)相比，對照組、25%毒素組和50%毒素組OM分別降低了1.29%、1.15%和0.90%，而且對照組發(fā)酵全程平均OM顯著低于50%毒素組，說明毒素影響了微生物發(fā)酵OM的能力，但其機(jī)理尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

3.3 鐮刀菌毒素對全價(jià)飼料發(fā)酵NH3-N的影響

NH3-N是衡量飼料質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，飼料中的氨氮過量，將會(huì)影響動(dòng)物體內(nèi)的正常生理活動(dòng)甚至生存[24]。研究表明，細(xì)菌、放線菌和霉菌對豬糞發(fā)酵過程中的NH3-N釋放具有良好的抑制作用[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，全價(jià)飼糧發(fā)酵初期，隨著毒素含量升高，飼料中的NH3-N含量逐漸降低，推測可能是鐮刀菌毒素對飼料中的NH3-N進(jìn)行了抑制或者鐮刀菌與飼料本身的其它菌共同作用抑制了NH3-N產(chǎn)生。NH3-N是飼料中蛋白質(zhì)、氨基酸和其他非蛋白氮化合物等分解的終產(chǎn)物[26]。組合菌種在發(fā)酵過程中分解蛋白質(zhì)變成氨，然后利用氨合成自身的菌體蛋白，這個(gè)過程中不是所有的氨都能被利用，最終導(dǎo)致發(fā)酵飼糧NH3-N濃度上升。本研究飼糧NH3-N的產(chǎn)生隨毒素水平升高而升高，與發(fā)酵初始(0天)相比，對照組、25%毒素組和50%毒素組NH3-N分別增加了281%、644%和1022%，對照組發(fā)酵全程的平均NH3-N顯著低于25%毒素組和50%毒素組。但是毒素影響NH3-N釋放的機(jī)理尚需進(jìn)一步證實(shí)。

3.4 鐮刀菌毒素對全價(jià)飼料發(fā)酵乳酸的影響

乳酸的產(chǎn)生，可以使總酸度提高，從而抑制了腐敗菌等有害菌的繁殖，有利于發(fā)酵飼料的長期保存[27]。酵母菌和枯草芽孢桿菌可以分泌α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等多種胞外酶[28]，分解營養(yǎng)物質(zhì)，生成糖類。在酵母菌和枯草芽孢桿菌幫助下，乳酸菌可利用這些碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸[29]，比單一乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸能力更高。本研究中，發(fā)酵末期(18 d)對照組、25%毒素組和50%毒素組的乳酸含量分別為發(fā)酵初始(0 d)的28.41、32.4和74.1倍。馮德明等[30]研究表明，主要以酵母菌和乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)黃酒過程中，乳酸含量隨著時(shí)間逐漸增加。崔彥召[31]也證明，運(yùn)用不同的乳酸菌劑對全混合日糧進(jìn)行發(fā)酵，各組乳酸含量逐漸增加，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本研究發(fā)酵末期飼糧乳酸含量隨毒素水平升高而顯著降低，對照組發(fā)酵全程的平均乳酸含量顯著高于25%毒素組，而25%毒素組乳酸含量又顯著高于50%毒素組。但是毒素影響乳酸產(chǎn)生的機(jī)理尚需進(jìn)一步證實(shí)。

3.5蒙脫石吸附劑對鐮刀菌毒素全價(jià)飼料發(fā)酵參數(shù)的影響

蒙脫石吸水性很強(qiáng)，吸水后膨脹，蒙脫石在水介質(zhì)中可分散呈膠體狀態(tài)，即晶格底面間距增大，在高水化狀態(tài)時(shí)晶軸C0可達(dá)1.84～2.14 nm[32]。因此推測蒙脫石吸附飼料中的部分水分間接引起H+升高，導(dǎo)致酸度降低。本實(shí)驗(yàn)條件下，添加CA的全程平均pH顯著低于不添加CA組。鐮刀菌毒素和CA對發(fā)酵12 d的乳酸具有顯著的交互作用。

4 結(jié)論

4.1 本實(shí)驗(yàn)條件下，飼糧pH和OM含量隨發(fā)酵時(shí)間顯著下降，而NH3-N和乳酸水平隨發(fā)酵時(shí)間顯著升高。

4.2 飼糧(0 d)的pH和NH3-N水平均隨鐮刀菌毒素水平升高顯著降低。發(fā)酵末期(18 d)飼糧pH隨毒素水平升高顯著升高；對照組NH3-N顯著低于兩個(gè)毒素組；而乳酸含量隨毒素水平升高顯著降低。發(fā)酵全程平均的pH和乳酸含量隨毒素水平升高顯著降低；對照組發(fā)酵全程的平均OM顯著低于50%的毒素組；對照組發(fā)酵全程的平均NH3-N顯著低于兩個(gè)毒素組。

4.3 添加CA的全程平均pH顯著低于不添加CA組。

4.4 鐮刀菌毒素和CA對發(fā)酵第12天的乳酸具有顯著的交互作用。

4.5 pH與OM、OM與NH3-N、NH3-N和乳酸呈顯著正相關(guān)，而pH與NH3-N、pH與乳酸、OM與乳酸呈顯著負(fù)相關(guān)。

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