大豆分離蛋白酶解液抗氧化性的近紅外光譜定量測(cè)定

周 博 邱智軍

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471023)

大豆肽是大豆蛋白經(jīng)酶水解獲得的短肽混合物[1]，也是大豆蛋白開發(fā)利用的研究熱點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn)大豆肽具有抗氧化、降血壓、降膽固醇、降血糖、抗疲勞等生理活性[2-3]。大豆肽主要有3種工業(yè)生產(chǎn)方法：酶解法、微生物發(fā)酵法和合成法，其中，酶水解法具有專一性強(qiáng)、條件溫和，無毒副作用的特點(diǎn)，而且對(duì)營(yíng)養(yǎng)幾乎無不良影響，受到人們的廣泛關(guān)注[4]?？寡趸宰鳛榇蠖闺闹T多生理功能的基礎(chǔ)，同時(shí)也是其生產(chǎn)制備工藝的重要質(zhì)量監(jiān)測(cè)指標(biāo)[5]。目前抗氧化檢測(cè)方法很多，且多是化學(xué)分析方法[6-7]，其需要耗費(fèi)大量的人力物力財(cái)力，而且耗時(shí)長(zhǎng)，分析效率低。近紅外光譜技術(shù)(NIRS)是近年來發(fā)展迅速的一種綠色分析技術(shù)，相對(duì)于傳統(tǒng)分析方法，具有無損樣品，成本效益低，勞動(dòng)效率高等優(yōu)點(diǎn)[8]，適于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的在線檢測(cè)。目前，在抗氧化檢測(cè)方面，近紅外光譜技術(shù)已經(jīng)被成功地應(yīng)用到可可豆、綠茶和大米等食品類物質(zhì)[9-12]。而以大豆肽抗氧化性為定量檢測(cè)目標(biāo)進(jìn)行近紅外光譜建模研究鮮見報(bào)道。

用不同的蛋白酶水解同一種大豆蛋白，其水解產(chǎn)物均具有抗氧化性，但不同蛋白酶作用位點(diǎn)不同，所得水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量以及氨基酸組成不同，從而影響了水解產(chǎn)物的抗氧化活性[13-14]。為了提高大豆多肽類產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)功能和加工特性，多酶復(fù)合水解也常用于大豆肽制備[15-16]。目前在大豆肽工業(yè)生產(chǎn)中常用的酶有堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，本研究擬選取上述4種酶分別對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行水解，對(duì)其水解樣品進(jìn)行近紅外光譜掃描，以期建立多酶水解液光譜與對(duì)應(yīng)抗氧化值之間的定量分析模型，探索同一模型應(yīng)用于不同酶的水解液抗氧化性測(cè)定的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中性蛋白酶(20萬 U/g)、堿性蛋白酶(20萬 U/g)、菠蘿蛋白酶(50萬 U/g)、木瓜蛋白酶(80萬 U/g)： 江蘇銳陽生物科技有限公司；大豆分離蛋白(食品級(jí))：鄭州博研生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)(Biotech Grade)：北京Ruitaibio公司。

1.2 主要儀器

VECTOR33傅里葉變換近紅外光譜儀：德國(guó)Brüker公司；DR6000可見光分光光度計(jì)：美國(guó)HACH公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

分別用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行酶促水解。水解條件分別為其產(chǎn)品說明書最適條件，具體條件見表1，在1 h內(nèi)間隔不同時(shí)間取樣，每種酶取樣29組，共116個(gè)樣品，分別進(jìn)行近紅外光譜掃描獲得光譜數(shù)據(jù)，同時(shí)測(cè)定其抗氧化值。由于操作失誤，木瓜酶用于近紅外光譜掃描的第28號(hào)樣品損失，實(shí)際用于本研究建模的樣品數(shù)為115。

表1 四種蛋白酶水解條件

1.3.2 抗氧化能力測(cè)定

由于缺乏一種標(biāo)準(zhǔn)方法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力，根據(jù)不同的目標(biāo)需要，目前使用的抗氧化測(cè)定方法非常多。本研究目的聚焦于探索構(gòu)建大豆蛋白酶解液抗氧化能力近紅外預(yù)測(cè)模型的可行性，并未全面評(píng)價(jià)樣品抗氧化性，而是選擇一種抗氧化研究中最常用的測(cè)定方法-DPPH法來測(cè)定樣品的抗氧化能力[17,18 ]。

用DPPH法測(cè)定四種酶解大豆蛋白產(chǎn)物的自由基消除量，以此指標(biāo)作為評(píng)價(jià)其抗氧化能力的指標(biāo)。主要步驟為取1mL樣液，加入1 mL的蒸餾水和2 mL配置好的0.004% DPPH溶液，充分混勻，避光靜置30 min后，以蒸餾水為陽性對(duì)照，甲醇為空白對(duì)照，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每一樣品重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。自由基清除量Y(mg/mL)按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A1為樣品吸光度或陽性對(duì)照吸光度；A2為空白對(duì)照吸光度。

1.3.3 近紅外光譜采集

將樣品裝入樣品杯中，采用近紅外透射采樣系統(tǒng)采集，光譜采集范圍為3 500～12 000 cm-1，掃描次數(shù)為32，分辨率為4 cm-1，采用蒸餾水為參比，測(cè)量時(shí)的環(huán)境溫度為20 ℃，濕度為35%。每個(gè)樣品采集3張光譜，取其平均光譜。

1.3.4 全波長(zhǎng)光譜和CARS法波長(zhǎng)篩選優(yōu)化模型構(gòu)建

由于物理變化可能對(duì)光譜有影響，因此原始光譜不可避免地包含系統(tǒng)噪聲或背景信息[19]。因此，需要適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理方法來減少不需要的光譜變化。本研究所有數(shù)據(jù)均采用Pareto scaling[20]方法進(jìn)行預(yù)處理。

全波長(zhǎng)光譜處理建模時(shí)，通過對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，利用偏最小二乘留一交叉驗(yàn)證法進(jìn)行近紅外光譜建模，所建模型用相關(guān)系數(shù)(R)和均方根誤差(RMSECV)來評(píng)價(jià)，其中R越接近1，RMSECV越小，模型精度越高，預(yù)測(cè)效果越好。

由于一些光譜區(qū)域包含來自環(huán)境的噪聲和干擾變量，因此可以通過一些選擇方法篩選出有效的校正模型變量而不是全光譜[21-22]，Li等[23]提出的競(jìng)爭(zhēng)性自適應(yīng)重加權(quán)抽樣(CARS)變量選擇方法就是一種波長(zhǎng)變量選擇方法，其主要思想是基于達(dá)爾文進(jìn)化論，運(yùn)用“生存之道”的機(jī)制，將PLS模型中回歸系數(shù)的絕對(duì)值用作評(píng)估每個(gè)變量重要性的指標(biāo)。然后根據(jù)每個(gè)變量的重要程度，CARS以迭代和競(jìng)爭(zhēng)的方式按照蒙特卡羅(MC)抽樣運(yùn)行順序去選擇N個(gè)子集的變量。此外，它采用了指數(shù)遞減函數(shù)(EDF)和自適應(yīng)重加權(quán)抽樣(ARS)來消除一類權(quán)重相對(duì)較小的變量。最后，校正集交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)最小的子集被認(rèn)為是變量的最優(yōu)組合[24]。目前已經(jīng)有很多研究證明CARS是復(fù)雜分析系統(tǒng)中強(qiáng)大而高性能的工具[25-26]。本研究將使用CARS方法進(jìn)行變量篩選從而優(yōu)化預(yù)測(cè)模型，優(yōu)化計(jì)算時(shí)，交叉驗(yàn)證參數(shù)選擇留一交叉驗(yàn)證法。

由于本研究中單個(gè)酶反應(yīng)樣本規(guī)模(29個(gè)樣品)非大樣本，所以，進(jìn)行模型優(yōu)化前后預(yù)測(cè)能力比較時(shí)，驗(yàn)證方法都選擇留一交叉驗(yàn)證法，然后使用決定系數(shù)(R)和均方根誤差(RMSECV)來評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)能力，考察CARS方法的有效性。

1.3.5 預(yù)測(cè)模型構(gòu)建與評(píng)價(jià)

將全部4種酶酶解的大豆分離蛋白酶解液樣本按DPPH自由基清除量從小到大排序，采用隔4選1的原則分別確定校正集和驗(yàn)證集[27]，最終得到92個(gè)校正集樣品，23個(gè)驗(yàn)證集樣品。光譜預(yù)處理方法采用Pareto scaling方法，CARS方法進(jìn)行波長(zhǎng)變量篩選(計(jì)算時(shí)其交叉驗(yàn)證參數(shù)選擇與校正集和驗(yàn)證集劃分一致，即五折交叉驗(yàn)證法)，用選擇到的最優(yōu)變量子集建立模型。采用校正集交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(Rcv)、預(yù)測(cè)集相關(guān)系數(shù)(Rp)、RMSECV、預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)和相對(duì)分析誤差[驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)偏差和預(yù)測(cè)集標(biāo)準(zhǔn)偏差的比值(RPD)]進(jìn)行模型性能評(píng)估，其中各評(píng)價(jià)指標(biāo)的計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[28]。通常一個(gè)好的模型應(yīng)該具有高的Rcv、Rp和RPD值，低的RMSECV和RMSEP值，并且RMSECV和RMSEP值的差異應(yīng)盡量小。

表2 4種酶的大豆蛋白水解液的DPPH清除量分析

注：采樣密度為樣品數(shù)和單位DPPH清除量范圍的比值。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)樣品的抗氧化值分析

本研究以清除DPPH自由基的程度來表示抗氧化性。4種不同的蛋白酶水解大豆分離蛋白，根據(jù)其水解時(shí)間不同，其水解產(chǎn)物的DPPH清除量也不同，不同采樣時(shí)間四種酶水解的大豆蛋白水解液的DPPH清除能力見表2。

表2給出了建模所用基礎(chǔ)數(shù)據(jù)(抗氧化值)的概況，對(duì)于不同酶解的采集樣本，其抗氧化能力的上限基本相當(dāng)，下限則差異較大，不同酶解樣本的抗氧化能力極差差異明顯，而樣本容量又基本相等，鑒于此種情況，要考慮采樣密度對(duì)模型的影響。構(gòu)建統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)模型時(shí)，采樣密度相當(dāng)于樣本容量，在影響因素相同的情況下，樣本容量越大，對(duì)統(tǒng)計(jì)量的估計(jì)或預(yù)測(cè)也就越準(zhǔn)確。所以，表2中增加了采樣密度項(xiàng)目，即單位目標(biāo)值(DPPH清除量)范圍上的采集樣品數(shù)，即：樣品數(shù)/極差。

2.2 近紅外原始光譜分析

4種蛋白酶水解大豆蛋白水解液樣本的近紅外原始光譜圖見圖1，可以發(fā)現(xiàn)4個(gè)近紅外原始光譜的整體趨勢(shì)相似，說明其中所含物質(zhì)的基團(tuán)是相似的，制樣時(shí)投入的不同酶物質(zhì)對(duì)整體光譜形態(tài)并未引起明顯變化。但同一種酶解樣本(單酶)的吸光度值有明顯變化，尤其是在2個(gè)高峰位置和波數(shù)3 500～5 000 cm-1范圍內(nèi)，吸光度的變異幅度很大。由圖1可以觀察到，4種酶樣本的吸光度變異幅度由大到小排序?yàn)椋簤A性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，這與表1中樣本的DPPH清除量極差情況相一致，這說明吸光度與抗氧化能力之間具有穩(wěn)定的相關(guān)性，這也預(yù)示了預(yù)測(cè)模型構(gòu)建的可行性。

圖1 近紅外原始光譜圖

2.3基于留一交叉驗(yàn)證的模型性能評(píng)價(jià)分析

光譜預(yù)處理可以有效地減少了一些類似水分子的強(qiáng)吸收噪聲的干擾，從而提高模型的精度，使其具有更好的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)性[29]。本實(shí)驗(yàn)中用pareto scaling方法對(duì)原始光譜經(jīng)過預(yù)處理后，利用偏最小二乘留一交叉驗(yàn)證法進(jìn)行近紅外光譜建模，使用了5個(gè)樣本數(shù)據(jù)建模：4個(gè)單酶樣本和由4個(gè)單酶樣本數(shù)據(jù)組成的混合樣本數(shù)據(jù)模型，即綜合樣本數(shù)據(jù)模型，結(jié)果列于表3。表3中數(shù)據(jù)結(jié)果分為兩部分：全波長(zhǎng)模型和CARS優(yōu)化模型，統(tǒng)一使用相關(guān)系數(shù)R和均方根誤差RMSECV評(píng)價(jià)其性能。

從表3中全波長(zhǎng)模型和CARS優(yōu)化模型的交叉驗(yàn)證結(jié)果，兩者比較，不管是單酶樣本數(shù)據(jù)還是綜合樣本數(shù)據(jù)，經(jīng)過CARS進(jìn)行變量篩選優(yōu)化后，相應(yīng)預(yù)測(cè)模型的Rcv和RMSECV均更為優(yōu)異，Rcv顯著提高，RMSECV顯著降低。這就說明經(jīng)過CARS法進(jìn)行變量篩選后，數(shù)據(jù)集的交叉驗(yàn)證模型精度均有顯著提高，模型預(yù)測(cè)性能也隨之提高。綜上所述，采用PLS結(jié)合CARS優(yōu)化對(duì)于構(gòu)建更為優(yōu)異的大豆蛋白酶解液抗氧化性數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)模型是可行且有效的。

表3 全波長(zhǎng)和CARS變量選擇后的留一法交叉驗(yàn)證結(jié)果

全波長(zhǎng)模型使用的光譜變量是原始光譜，包含4 499個(gè)不同波長(zhǎng)上的吸光度。而CARS 變量選擇法可有效選擇與所測(cè)性質(zhì)相關(guān)的最優(yōu)變量組合，預(yù)測(cè)結(jié)果往往優(yōu)于全譜偏最小二乘法(FS-PLS)[29]。CARS法篩選出的4個(gè)單酶樣本和一個(gè)綜合樣本最優(yōu)變量子集的變量個(gè)數(shù)分別為31個(gè)、27個(gè)、22個(gè)、25個(gè)、105個(gè)，波長(zhǎng)范圍分別是4 817.3～7 139.1 cm-1、4 026.3～7 114.1 cm-1、4 124.9～7 096.7 cm-1、4 080.6～7 121.8 cm-1、3 741.2～7 204.7 cm-1。從4個(gè)單酶樣本數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)模型的最優(yōu)變量子集來看，篩選到的變量個(gè)數(shù)大致相當(dāng)，其波長(zhǎng)分布范圍主體范圍重疊，說明盡管不同酶物質(zhì)的加入增加了樣本間的差異，但這些差異并未完全主導(dǎo)模型的預(yù)測(cè)基礎(chǔ)。相比較而言，綜合樣本數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)模型的最優(yōu)變量子集個(gè)數(shù)增加了數(shù)倍，波長(zhǎng)范圍與單個(gè)酶數(shù)據(jù)模型的一致且相對(duì)擴(kuò)大，這說明綜合樣本數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)模型為了準(zhǔn)確預(yù)測(cè)多個(gè)酶解體系數(shù)據(jù)，增加了相應(yīng)的波長(zhǎng)變量以描述不同酶解體系數(shù)據(jù)的差異。

2.4采樣密度和酶物質(zhì)差異對(duì)模型性能的影響分析

本研究使用的采樣方法使得表2中5個(gè)模型的采樣密度不一致。采樣密度越大，由此構(gòu)建的統(tǒng)計(jì)預(yù)測(cè)模型性能會(huì)越好。CARS優(yōu)化模型由于每個(gè)樣本模型使用的波長(zhǎng)變量不同，模型條件明顯不一致，故而無法在此基礎(chǔ)上討論采樣密度的影響。全波長(zhǎng)模型使用的波長(zhǎng)變量和模型算法PLS都是相同的，除了采樣密度外，樣本間的差異就只有加入的酶物質(zhì)不同。每個(gè)單酶樣本內(nèi)，酶物質(zhì)條件是相同的，樣本間則酶物質(zhì)條件不同，其對(duì)模型性能的影響無法簡(jiǎn)單分析確定。

假設(shè)檢驗(yàn)方法可以用來分析酶物質(zhì)差異對(duì)單酶樣本數(shù)據(jù)模型的影響。在其他條件一致的情況下，采樣密度對(duì)模型性能有確定性影響，即，采樣密度和模型性能之間是相關(guān)的。如果統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)顯著，就可以認(rèn)為不存在采樣密度以外的其他因素的顯著影響，也就是說，酶物質(zhì)差異對(duì)單酶樣本數(shù)據(jù)模型的性能沒有顯著影響。反之則說明酶物質(zhì)差異對(duì)單酶樣本數(shù)據(jù)模型的性能有顯著影響。對(duì)于4個(gè)單酶樣本數(shù)據(jù)模型，先假設(shè)酶物質(zhì)差異對(duì)模型性能無顯著影響，然后計(jì)算2個(gè)參數(shù)(采樣密度和模型性能)的相關(guān)性。采樣密度使用表1中數(shù)據(jù)，模型性能使用表2中相應(yīng)全波長(zhǎng)模型的RMSECV值，計(jì)算相關(guān)性r=-0.960，P=0.04。由于P<0.05，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采樣密度和模型性能之間相關(guān)性顯著，說明酶物質(zhì)差異對(duì)單酶樣本數(shù)據(jù)模型的性能沒有顯著影響。

對(duì)于4個(gè)單對(duì)酶樣本數(shù)據(jù)組成的混合樣本數(shù)據(jù)模型，即綜合樣本數(shù)據(jù)模型，如表2所述，其RMSECV值為0.008 2，即0.002 1

圖2 采樣密度與RMSECV線性關(guān)系圖

2.5 預(yù)測(cè)模型的測(cè)試評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的可行性，需要構(gòu)建獨(dú)立的驗(yàn)證集來對(duì)模型進(jìn)行測(cè)試評(píng)價(jià)。另外，留一交叉驗(yàn)證表明，由于混合酶條件影響，相對(duì)于單酶樣本數(shù)據(jù)模型，綜合樣本數(shù)據(jù)模型性能有所下降；且也可以看到CARS方法對(duì)于模型性能的提升作用。所以CARS優(yōu)化模型被用于本小節(jié)的模型驗(yàn)證。

表4 近紅外模型校正和預(yù)測(cè)結(jié)果

由抗氧化值及相應(yīng)預(yù)測(cè)值得到散點(diǎn)圖3，通過觀察其散點(diǎn)分布，初步認(rèn)定沒有異常點(diǎn)。之后，將所有樣品按照抗氧化值從小到大排序，采用隔4取1法劃分為校正集和驗(yàn)證集。基于校正集，CARS方法篩選得到最優(yōu)變量子集，由此建立的PLS預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果見表4，真實(shí)值與預(yù)測(cè)值之間的相關(guān)性見圖4。由表4中的數(shù)據(jù)可以看出，預(yù)測(cè)集的RMSEP大于校正集的RMSECV，其差值為0.002 5，大約相當(dāng)于校正集和驗(yàn)證集樣本標(biāo)準(zhǔn)差s(分別為0.014 3和0.013 0)的五分之一，即小于0.2s，可以認(rèn)為兩者差異不大，說明建模樣本和驗(yàn)證樣本的代表性均比較好；另外，相對(duì)分析誤差RPD也接近2.5，這些都表明模型具有很高的精度和較好的預(yù)測(cè)能力，而且其預(yù)測(cè)模型也比較穩(wěn)定。

圖3 綜合樣本CARS-PLS的交叉檢驗(yàn)法結(jié)果

圖4 近紅外模型的校正集、驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)值和真實(shí)值的相關(guān)性

3 結(jié)論

本研究采用近紅外光譜技術(shù)分別對(duì)菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解的大豆蛋白水解液的近紅外圖譜進(jìn)行光譜預(yù)處理和CARS變量的篩選，比較了四種單個(gè)酶樣品和綜合酶樣品近紅外全波長(zhǎng)算法和結(jié)合CARS算法后交叉驗(yàn)證模型的各個(gè)指標(biāo)，再結(jié)合DPPH法測(cè)得四種酶水解的大豆蛋白水解液清除的DPPH含量進(jìn)行建模，通過校正集的Rcv、RMSECV和驗(yàn)證集的Rp、RMSEP和模型的RPD值來評(píng)價(jià)四種酶水解的大豆蛋白水解液抗氧化性近紅外定量分析模型的擬合效果與預(yù)測(cè)功能。另外，通過分析采樣密度和酶物質(zhì)對(duì)模型精度的影響，探究了同一模型應(yīng)用于不同酶的水解液抗氧化性測(cè)定的可行性。結(jié)果表明，利用PLS和CARS算法結(jié)合可以大大提高模型的精確度，并由這個(gè)模型建立了一種基于近紅外光譜結(jié)合CARS算法預(yù)測(cè)多種酶水解的大豆分離蛋白酶解液抗氧化活性的定量方法，從得到的模型評(píng)價(jià)參數(shù)可看出，大豆蛋白酶解產(chǎn)物的近紅外光譜與抗氧化活性之間存在很好的相關(guān)性，其中Rcv為0.960 1，Rp為0.923 7，RMSECV和RMSEP分別為0.002 8 mg和0.005 3 mg，RPD值為2.45。

本研究方法和傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法相比，基于近紅外光譜的抗氧化活性預(yù)測(cè)方法具有高效綠色，不消耗任何溶劑，分析成本低、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。由本文建模效果評(píng)價(jià)來看，近紅外光譜方法能夠比較可靠地對(duì)多種蛋白酶水解蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化性檢測(cè)，這也預(yù)示著近紅外方法在多肽類產(chǎn)品抗氧化性檢測(cè)方面的潛在應(yīng)用前景。隨著近紅外光譜技術(shù)的發(fā)展，以及近紅外數(shù)據(jù)處理方法的研究與有效使用，利用近紅外光譜技術(shù)建立的模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性也會(huì)大大提高，這都將有助于多肽類產(chǎn)品高效質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的建立。

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