葶藶生脈方中黃芪、麥冬總皂苷的提取及其含量測定

李佳佳 鄭文麗 張華潭 李春花

[摘要] 目的 研究葶藶生脈方中黃芪、麥冬皂苷的含量測定方法，并以其含量為指標(biāo)優(yōu)選黃芪、麥冬的最佳提取工藝。 方法 選用以香草醛-冰醋酸-高氯酸為顯色劑，紫外分光光度法測定總皂苷的含量。采用正交試驗法，以總皂苷的含量為評價指標(biāo)，考察乙醇濃度、料液比和提取時間對提取工藝的影響，優(yōu)選黃芪、麥冬的最佳提取工藝。 結(jié)果 本研究中黃芪甲苷在8.88～44.40 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性試驗的RSD值均≤1.19%，平均加樣回收率為101.78%，RSD值為1.85%（n = 9）。最佳提取工藝：8倍量80%的乙醇回流提取2次，每次2 h。 結(jié)論 該方法操作簡便，準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為葶藶生脈方中黃芪、麥冬皂苷質(zhì)量控制的方法。

[關(guān)鍵詞] 黃芪；麥冬；總皂苷；葶藶生脈方；提取工藝；正交試驗

[中圖分類號] R284.2 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（c）-0128-04

Extraction and content determination of total saponins from Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction

LI Jiajia1 ZHENG Wenli2 ZHANG Huatan3 LI Chunhua4

1.Grduate School， Hebei University of Chinese Medicine， Hebei Province， Shijiazhuang 050090， China； 2.Department of Pharmacy， Shijiazhuang Second Hospital， Hebei Province， Shijiazhuang 050051， China； 3.Shijiazhuang Keren Pharmaceutical Technology Co.， Ltd， Hebei Province， Shijiazhuang 050035， China； 4.College of Pharmacy， Hebei University of Chinese Medicine， Hebei Province， Shijiazhuang 050200， China

[Abstract] Objective To study the content determination method of total saponins from Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction， and to optimize the optimum extraction process of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix taking the contents as indices. Methods The vanillic aldehyde-glacial acetic acid-perchloric acid was selected as color developing agent， and the contents of total saponins were detected by ultraviolet spectrophotometry. By using orthogonal experiment， taking the contents of total saponins as indices， the effects of ethanol concentration， solid-liquid ratio and extraction duration for the extraction process were investigated， so as to optimize the optimum extraction process of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix. Results In this study， astragaloside Ⅳ showed a good linear relationship within the range of 8.88-44.40 μg， all the RSD values of degree of precision， stability and repeatability experiments were ≤1.19%， the average recovery rate was 101.78%， RSD was 1.85% （n = 9）. The optimum extraction process： reflux extraction of 8 times amount of 80% ethanol was taken for 2 times， once 2 h. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， which can be used as a method for the quality control of Astragali Radix and Ophiopogonis Radix in Tingli Shengmai Decoction

[Key words] Astragali Radix； Ophiopogonis Radix； Total saponins； Tingli Shengmai Decoction； Extraction process； Orthogonal experiment

葶藶生脈方是全國名老中醫(yī)邢月朋治療氣虛血瘀、陽虛水停型充血性心力衰竭（CHF）的經(jīng)驗方，該方是由葶藶子、黃芪、麥冬、紅參、五味子、桂枝、茯苓、白術(shù)、豬苓、澤瀉、丹參、紅花、川芎組成，被列為國家“十一五”科技支撐計劃項目。為將葶藶生脈方開發(fā)為現(xiàn)代制劑，我們探索適于方中黃芪、麥冬工業(yè)生產(chǎn)的工藝參數(shù)。方中黃芪、麥冬含有皂苷類成分，且均為有效成分。現(xiàn)代藥理研究已證實：黃芪皂苷有強心作用，尤以黃芪甲苷具有明顯的正性肌力作用，可以改善心臟收縮和舒張功能[1-4]；麥冬皂苷對心肌細胞缺氧再給氧損傷具有保護作用[5-6]。文獻中多為黃芪、麥冬單味藥材的提取研究[7-10]，本研究將對黃芪、麥冬藥對進行提取工藝的優(yōu)化，為實際生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TU-1900紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電子天平（天津天平儀器有限公司，TD200/型）；分析天平（上海精科儀器廠，TG328B型）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-100E型）；立式電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，DGF-4A型）；有機系（0.22 μm）微孔濾膜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠，RE-52型）；調(diào)溫型電熱套（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

黃芪、麥冬藥材購于石家莊樂仁堂，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院侯芳潔講師鑒定符合2015版《中國藥典》一部相關(guān)項下規(guī)定。黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-200613）；甲醇（色譜純，批號：A2005-0001）購于美國Grace公司；香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙醇、正丁醇、氫氧化鈉等均為分析純，雙蒸水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，置5 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容，備用。得黃芪甲苷的濃度為0.4442 mg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

根據(jù)組方配比，稱取黃芪30 g；麥冬10 g ；黃芪30 g+麥冬10 g；分別加入6倍量80%乙醇，回流提取2次，每次2 h。合并提取液，分別減壓回收乙醇144、48、192 mL。精密移取提取液5 mL，用水飽和正丁醇振搖萃取3次，每次7.5 mL，合并正丁醇層，后用0.1 mol/L的NaOH溶液洗滌正丁醇層2次，每次10 mL，蒸干回收正丁醇層，用甲醇溶解，置10 mL容量瓶，定容。精密吸取一定量的溶液，水浴蒸干，甲醇溶解，置25 mL容量瓶，定容，使每組溶液所含總生藥量為0.02 g/mL[11-12]。

2.3 檢測波長的確定

精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.6 mL，供試品溶液分別1 mL至具塞試管中，水浴揮干，分別精密加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60℃水浴加熱15 min，取出立即冰浴5 min，加入5 mL冰醋酸。隨行試劑為空白試劑，在350～800 nm處掃描。見圖1。結(jié)果顯示：對照品和供試品在470 nm處有最大吸收。樣品的測定結(jié)果以黃芪甲苷為基準(zhǔn)來測定黃芪、麥冬總皂苷的含量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別吸取上述黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，置5個具塞試管中，水浴揮干，按照“2.3”項下方法，在470 nm出測定吸收值，以含量（M，mg）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為：A = 13.6149 M - 0.0115，r = 0.9998（n = 5），線性范圍為8.88～44.40 μg。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)黃芪甲苷的含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度實驗 精密吸取黃芪甲苷對照品溶液6份，每份0.6 mL，按照“2.3”項下方法測定在470 nm處的吸收值，計算RSD值。結(jié)果顯示RSD值為0.44%（n = 6），表明該儀器精密度較好。

2.4.3 重復(fù)性實驗 稱取黃芪30 g、麥冬10 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，平行取6份，每份1 mL，置具塞試管中，按照“2.3”項下方法測定在470 nm處的吸收值，計算RSD值。結(jié)果顯示RSD值為0.13%（n = 6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性實驗 精密吸取黃芪甲苷0.6 mL，“2.4.3”項樣品溶液1 mL，置具塞試管中，按照“2.3”項下方法，分別于0、5、10、15、20、30 min測定在470 nm處的吸收值，計算RSD值。結(jié)果顯示RSD值為1.19%，表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液顯色后在30 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率實驗 精密吸取已知含量的供試品溶液9份于10 mL容量瓶中，3份為一組，加入對照品溶液0.051、0.103、0.152 mL，甲醇定容，按照“2.3”項下方法測定在470 nm處的吸收值，計算RSD值。計算黃芪甲苷平均加樣回收率分別為101.78%，RSD為1.85%（n = 9）。見表1。

2.5 正交試驗優(yōu)選黃芪、麥冬提取工藝

2.5.1 正交試驗設(shè)計與結(jié)果 通過查閱大量文獻，確定考察因素[13-16]，采用正交試驗設(shè)計，以乙醇用量（A）、乙醇濃度（B）、提取時間（C）為考察因素，以總皂苷含量為評價指標(biāo)，用L9（34）正交表安排實驗，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3”項下方法測定總皂苷含量，從而確定黃芪、麥冬總皂苷提取的最佳工藝，因素水平見表2，正交實驗安排及結(jié)果見表3，方差分析表見表4。

2.5.2 最佳提取工藝的確定 從表2和表3可知：根據(jù)極差的大小，各因素對實驗結(jié)果的影響順序為B>C>A，即：乙醇濃度>提取時間>乙醇用量，方差結(jié)果顯示，乙醇濃度對提取工藝具有顯著性影響，而乙醇用量與提取時間對該工藝無顯著影響。結(jié)合正交試驗結(jié)果最佳提取工藝為A3B2C3。即為10倍量80%乙醇，提取2次，每次2 h。根據(jù)表2可知乙醇用量為次要影響因素，因此出于對資源節(jié)約、生產(chǎn)實際等方面的需要，確定乙醇的用量為8倍量。

2.5.3 最優(yōu)提取工藝驗證試驗 按處方規(guī)定量稱取黃芪、麥冬藥材，共3份，依據(jù)確定的最優(yōu)工藝參數(shù)進行驗證試驗，結(jié)果總皂苷的含量分別是7.036、7.235、7.195 mg/g，均比正交試驗中的9組高，表明該研究確定的工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

比色法是測定總皂苷含量的經(jīng)典方法[17-20]。常用的有香草醛-冰醋酸-高氯酸、香草醛-濃硫酸以及高氯酸三種顯色方法[21]。本研究就曾通過比較三種方法的優(yōu)劣，選擇香草醛-冰醋酸-高氯酸為最佳的顯色劑。原因是香草醛-濃硫酸法顯色不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差，測定數(shù)據(jù)誤差大，所以不能用于定量分析。而以高氯酸為顯色劑時，黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液最大吸收波長與黃芪麥冬提取液的最大吸收波長相差很多。香草醛-冰醋酸-高氯酸法，反應(yīng)靈敏，黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液與黃芪麥冬提取液的在470 nm處都有較強吸收，且重現(xiàn)性良好，因此選用此種顯色劑和黃芪甲苷為標(biāo)準(zhǔn)品來測定總皂苷的含量。

總皂苷采用比色法進行含量測定時，對所需試劑的溫度及時間對其影響較大[22]。如本研究中顯色劑使用時應(yīng)該新鮮配制，因為香草醛容易被氧化而逐漸分解，使得空白溶液顏色加深，所以在水浴過后30 min之內(nèi)完成對總皂苷的含量測定，以免影響測定結(jié)果；其反應(yīng)溫度應(yīng)控制在60℃，當(dāng)溫度過高且長時間加熱時，可能會有多糖類成分造成干擾；這些因素都會對實驗結(jié)果產(chǎn)生誤差，因此這一過程操作應(yīng)格外注意。

用水飽和的正丁醇萃取為了使其吸濕能力下降，萃取時不會將水中的化合物一并吸附，分層效果好，可防止萃取過程中產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象，可以縮短萃取時間，提高萃取效率，后用0.1 mol/L的NaOH洗滌正丁醇層是用堿皂化反應(yīng)不完全的酯類生成鈉鹽而易溶于水。

香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色原理是高氯酸使苷元的酚羥基氧化為羧基，增加一個雙鍵結(jié)構(gòu)，再經(jīng)雙鍵位移，雙分子縮合等反應(yīng)生成共軛雙鍵系統(tǒng)，又在酸的作用下形成陽碳離子鹽而顯色。

本研究采用比色法測定皂苷的總含量，方法簡單，準(zhǔn)確易行，為葶藶生脈方中黃芪、麥冬皂苷的定量分析提供了快速、有效的分析方法。

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（收稿日期：2017-12-19 本文編輯：張瑜杰）