經(jīng)關節(jié)穿刺注射ADSCs修復兔激素性股骨頭壞死的研究

譚偉源 安榮澤 齊新文 謝嘉清

[摘要] 目的 探討經(jīng)關節(jié)穿刺注射脂肪源性干細胞（ADSCs）修復兔激素性股骨頭缺血性壞死的療效。 方法 取成年新西蘭大白兔頸背部脂肪組織提取脂肪源性干細胞培養(yǎng)并傳代，36只新西蘭大白兔通過馬血清聯(lián)合激素法建立激素性股骨頭缺血性壞死模型，隨機分為對照組、髓芯減壓組及ADSCs組，每組各12只，并作骨密度檢測。對照組不作干預處理，髓芯減壓組股骨頭鉆孔減壓，ADSCs組經(jīng)關節(jié)穿刺注射ADSCs。分別于干預后4、8周每組取6只兔行骨密度檢測及X線檢查，處死后收集股骨頭樣本作大體觀察，采用HE染色及PCR檢測BMP-2 mRNA的表達，通過各組比較探討經(jīng)關節(jié)穿刺注射ADSCs修復激素性股骨頭缺血性壞死的效果。 結果 干預后4、8周，三組骨密度呈下降趨勢，但對照組下降幅度更大，與髓芯減壓組、ADSCs組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），而髓芯減壓組與ADSCs組相比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；大體觀察、影像學及組織學表現(xiàn)，干預后4、8周與對照組比較，經(jīng)關節(jié)穿刺注射ADSCs及髓芯減壓均可延緩股骨頭壞死的進展，對股骨頭壞死起修復作用，ADSCs組優(yōu)于髓芯減壓組；干預后4、8周，ADSCs組及髓芯減壓組BMP-2 mRNA的表達水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），而髓芯減壓組與ADSCs比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 經(jīng)關節(jié)穿刺注射ADSCs對兔激素性股骨頭缺血性壞死有修復作用。

[關鍵詞] 激素性股骨頭缺血性壞死；脂肪源性干細胞；關節(jié)穿刺；修復

[中圖分類號] R6874 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0175-06

Repair of rabbit steroid-induced avascular necrosis of femoral head by ADSCs injection through the joint puncture

TAN Weiyuan AN Rongze QI Xinwen XIE Jiaqing

Department of Orthopedics， the Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College， Guangdong Province， Zhuhai 519100， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of adipose derived stem cells （ADSCs） injection through the joint puncture on the repair of steroid-induced avascular necrosis of femoral head in rabbits. Methods ADSCs were isolated and passaged from the neck adipose tissue of adult New Zealand white rabbits. Thirty-six New Zealand white rabbits were used to establish the model of steroid-induced avascular necrosis of femoral head by horse serum combined with hormone. These rabbits were randomly divided into control group， core decompression group and ADSCs group （12 rabbits in each group）， and all for bone density detection. Control group：no intervention； core decompression group： femoral head drilling decompression； ADSCs group：by intra-articular injection of ADSCs. At 4 weeks and 8 weeks after intervention， 6 rabbits in each group were examined with bone mineral density （BMD） and X-ray examination. After the death， their femur samples were collected for gross observation， HE staining and PCR were used for the measurement of BMP-2 mRNA. Through the comparison of each group to explore the effect of ADSCs repairing steroid-induced avascular necrosis of the femoral head by joint puncture injection. Results 4 weeks and 8 weeks after intervention three groups of BMD， but the control group decreased， compared with core decompression group and ADSCs group were statistically significant （P < 0.05）， but there was no significant difference between the core decompression group and the ADSCs group （P > 0.05）. General observation， imaging and histological findings at 4 weeks and 8 weeks after intervention， compared with the control group， ADSCs treatment by joint puncture injection and core decompression both can delay the progress of femoral head necrosis. There had a repair effect on femoral head necrosis， and the effects in ADSCs group were better than those in core decompression group； at 4 weeks and 8 weeks after intervention， the expression of BMP-2 mRNA in the ADSCs group and the core decompression group were both higher than those in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）， while there was no significant difference between the core decompression group and the ADSCs group （P > 0.05）. Conclusion ADSCs injected through the joint puncture can repair the steroid induced avascular necrosis of the femoral head in rabbits.

[Key words] Avascular necrosis of the femoral head； Adipose-derived stem cells； Joint puncture； Repair

股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head，ANFH）是骨科全球性難治性疾病之一[1]，目前隨著激素類藥物的廣泛應用，激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SAFNH）發(fā)病率逐年上升，在我國已成為最常見的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死[2-3]。SAFNH治療困難且致殘率高，其發(fā)病機制尚未完全明確[4]。有研究指出，干細胞在股骨近端的數(shù)量減少及活性減弱可能是導致SAFNH的根本原因[5-6]。因此干細胞的研究對進一步探討SANFH的發(fā)病機制與治療方法具有重要意義。本研究通過經(jīng)關節(jié)穿刺注射脂肪源性干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）植入激素所致的壞死股骨頭處，通過局部檢測，探討ADSCs在早期SAFNH治療中的修復作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：健康新西蘭大白兔43只，雌雄不拘，成年，體重2.5～3.5 kg，合格證號：SCXK（粵）20140035。常規(guī)飲食水，分籠飼養(yǎng)，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

主要試劑及儀器設備：DMEM培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清、馬血清（華聯(lián)科生物技術有限公司）；DR影像X射線機（德國西門子公司）；3.0T核磁共振成像儀（德國西門子公司）；PCR儀（珠海黑馬公司）；雙能X線骨密度儀（法國OSTEOCORE2）。

1.2 方法

1.2.1 兔激素性股骨頭缺血性壞死模型的建立

42只新西蘭大白兔均應用馬血清以10 mL/kg，經(jīng)耳緣靜脈注射，3周后，馬血清減量至5 mL/kg，再次經(jīng)耳緣靜脈注射，再2周后，腹腔注射甲基強的松龍45 mg/kg，連續(xù)3 d，每天注射1次（每次注射均重新稱重）。注射馬血清及激素期間，每天每只動物肌肉注射青霉素10萬U，連續(xù)7 d，預防感染。

1.2.2 兔ADSCs的分離傳代和特性觀察

取健康新西蘭大白兔（非造模兔）1只麻醉后消毒鋪無菌巾，切取頸背部脂肪組織約3 g，去除淺筋膜及血管組織，PBS液反復沖冼干凈，用剪刀剪至糊狀，用0.1%Ⅰ型膠原酶在37℃溫箱中消化，離心后棄上清，重懸沉淀后過濾，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃體積分數(shù)為5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后換液，見ADSCs貼壁生長，待細胞長滿培養(yǎng)瓶面積的80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化，進行原代傳代，倒置顯微鏡下觀察脂肪干細胞的形態(tài)，繪制ADSCs生長曲線。流式細胞術測定3代脂肪源性干細胞CD14、CD45抗原的表達進行鑒定。將細胞制成2×106個/mL的混合懸液備用。

1.2.3 動物分組及ADSCs移植

造模兔經(jīng)最后一次注射甲基強的松龍后6周，行X線檢查見股骨頭局部密度增高，形態(tài)變扁，并見囊性變確立AFNH模型造模成功后，選36只模型兔分為三組：對照組、髓芯減壓組及ADSCs組，每組各12只。每組兔均行骨密度檢測。對照組：不作處理。髓芯減壓組：10%水合氯醛按3 mL/kg經(jīng)腹腔注射麻醉模型兔后，消毒、鋪無菌巾，X線下定位用直徑3.5 mm鉆頭從股骨頸的后內(nèi)側(cè)向股骨頭鉆孔，深度為鉆頭達關節(jié)軟骨即可，術后連續(xù)5 d臀大肌注射青霉素8×104 U/d，預防手術后感染。ADSCs組：10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉模型兔后，行髖關節(jié)穿刺，X線定位下見注射器尖端達股骨頭后，注射5 mL ADSCs。

1.3 主要觀察指標

1.3.1 影像學及大體觀察

分別于干預后4、8周，各組分批選6只兔進行X線攝片檢查及骨密度（bone mineral density，BMD）測定（采用雙能骨密度儀小動物模式測定兔股骨BMD），處死后取骨頭標本作大體觀察。

1.3.2 組織學檢查

1.3.2.1 病理觀察 于干預后4、8周各組股骨頭樣本用多聚甲醛固定，經(jīng)脫鈣3周后包埋、切片（5 μm厚度）進行HE染色，鏡下觀察類骨質(zhì)、新生骨小梁與骨髓組織；

1.3.2.2 PCR檢測各組股骨頭中骨形態(tài)蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的表達 各時間段各組股骨頭松質(zhì)骨樣本取100 mg磨至粉末，轉(zhuǎn)移至含Trizol離心管中，反復振蕩，離心后吹打裂解細胞。進行相分離、RNA沉淀、RNA洗滌及溶解提取RNA。在PCR管中加入RNA，引物混合物進行逆轉(zhuǎn)錄，PCR定量測定BMP-2 mRNA表達。PCR反應體系：cDNA 5 μL，上游引物（CGTGAGGATTAGCAGGTCTTT）0.5 μL，下游引物（GGCGTTTCCGCTGTTTG）0.5 μL，SYBR？誖 Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）10 μL，ddH2O 4.0 μL，95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 34 s（收集熒光信號）；40個循環(huán)；分析溶解曲線（溫度60～95℃，每分鐘讀1次）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)差異，組間兩兩比較采用SNK法，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物分析

經(jīng)馬血清聯(lián)合大劑量激素造模，造模過程中實驗兔死亡4只，剩余兔于最后一次注射甲基強的松龍后6周，行X線片檢查均見兔股骨頭密度降低并囊性變，股骨頭形態(tài)欠規(guī)則（圖1），造模成功。

2.2 ADSCs的特性觀察

原代ADSCs接種于培養(yǎng)瓶后初為圓形、橢圓形，12 h后可見部分細胞貼膜生長，為長梭形，24 h觀察見細胞已全部貼壁生長，于5 d后見細胞生長達培養(yǎng)瓶面積的80%，細胞呈長梭形。經(jīng)消化、傳代后細胞3 d可生長達培養(yǎng)瓶面積的80%，生殖速度較原代快，第2、3代細胞呈梭形，經(jīng)3次傳代，細胞形態(tài)穩(wěn)定（圖2）。取第三代ADSCs作流式細胞檢測，測得低表達細胞相關標志物CD14為0.41%（<5%），CD45為3.26%（<5%），檢測合格。

2.3 影像學表現(xiàn)

X線平片：干預后4周對照組及髓芯減壓組、ADSCs組均見股骨頭密度降低并囊性變，股骨頭形態(tài)不規(guī)則，對照組出現(xiàn)“蘑菇頭”樣改變，而髓芯減壓組、ADSCs組未見此改變（圖3）。干預后8周對照組見囊性變加重，軟骨下骨塌陷，出現(xiàn)硬化帶，股骨頭變扁。髓芯減壓組見股骨頭硬化帶，股骨頭不規(guī)則，見囊性變，但無明顯塌陷。ADSCs組見股骨頭低密度區(qū)，股骨頭欠圓滑，囊性變，但無明顯塌陷（圖4）。

2.4 大體觀察

干預后4周，對照組股骨頭標本色澤蒼白，形態(tài)不規(guī)則，股骨頭變扁；髓芯減壓組：股骨頭標本色澤蒼白，軟骨見剝脫，股骨頭形態(tài)欠規(guī)則，未見股骨頭變扁。ADSCs組股骨頭標本色澤蒼白，軟骨見剝脫，股骨頭欠光滑，股骨頭未見塌陷變扁。見圖5。

干預后8周，對照組股骨頭標本色澤蒼白，股骨頭變扁、塌陷；髓芯減壓組：股骨頭標本色澤蒼白，軟骨見剝脫加重，未見股骨頭塌陷變扁。ADSCs組股骨頭標本色澤蒼白，軟骨見剝脫，股骨頭欠光滑，股骨頭未見塌陷變扁。見圖6。

2.5 骨密度檢測

各組動物不同時間點BMD測定結果顯示在干預后4、8周各組骨密度值都較前有所下降，但對照組下降明顯，與髓芯減壓組、ADSCs組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），而干預后4、8周髓芯減壓組、ADSCs組BMD下降幅度小，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.6 各組股骨頭中BMP-2 mRNA的表達

各組動物不同時間點BMP-2 mRNA測定結果顯示，干預后4、8周對照組BMP-2 mRNA呈逐漸下降趨勢，與髓芯減壓組、ADSCs組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。而髓芯減壓組、ADSCs組干預后4周BMP-2 mRNA的表達量均比對照組高，并于干預后8周較前上升，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.7 組織形態(tài)學改變

各組干預后4、8周組織形態(tài)學變化：干預后4周，對照組見空骨陷窩，骨小梁變細，結構紊亂髓內(nèi)造血組織減少；髓芯減壓組見空骨陷窩少量，毛細血管減少，較多骨小梁出現(xiàn)，但多為幼稚骨小梁；ADSCs組見較少空骨陷窩，有新生骨小梁形成，骨小梁修復及形成未成熟。干預后8周，對照組：骨陷窩增多，骨小梁變細，結構紊亂，部分骨小梁斷裂；髓芯減壓組：見新生骨小梁較前增多，排齊較前明顯整齊，骨髓組織成熟；ADSCs組的骨小梁相對較粗，增生活躍且成熟，排列整齊且飽滿致密。見圖7。

3 討論

激素性股骨頭缺血性壞死為臨床最常見的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死[7] ，指大劑量長時間應用糖皮質(zhì)激素后引致的股骨頭血供障礙，出現(xiàn)軟骨細胞及骨細胞壞死，并伴有局部骨質(zhì)疏松，最終導致股骨頭塌陷的一種疾病[8]。目前激素性ANFH的確切發(fā)病機制仍未明，國內(nèi)外學者提出如脂肪栓塞、高凝狀態(tài)等多種假說[9]，但都未能完全闡述SAFNH的發(fā)病本質(zhì)。目前針對早期SANFH的治療手段有髖關節(jié)牽引制動、髓芯減壓、鉭棒植入等，而髓芯減壓為治療早期SANFH的常用方法[10]。髓芯減壓通過降低髓內(nèi)壓、刺激細胞再生對延緩股骨頭壞死有一定作用，但創(chuàng)傷較大，并且遠期療效欠滿意[11]。尋找成本相對低、創(chuàng)傷小且更為有效的新療法是目前股骨頭壞死治療研究的重點，干細胞療法的出現(xiàn)帶來了新的曙光[12]。

早已有研究發(fā)現(xiàn)股骨頭缺血性壞死的發(fā)病與干細胞的成骨能力有關[13]，并且有報道指出經(jīng)局部移植骨髓間充質(zhì)干細胞可對ANFH起修復作用[14]。說明干細胞在股骨頭壞死的發(fā)病及其修復中具有重要作用。ADSCs為取材容易、分向能力強，性質(zhì)穩(wěn)定的一類ADSCs[15]。目前已有研究報道通過股骨頭鉆孔植入ADSCs可成功減緩股骨頭缺血壞死的發(fā)展進程[16-17]，但均采用股骨頭切開鉆孔植入含ADSCs明膠海綿，此治療方法創(chuàng)傷較大。本次實驗嘗試采用簡單的經(jīng)關節(jié)穿刺注射方法移植ADSCs，并與對照組、髓芯減壓組作比較，觀察其對激素性股骨頭缺血性壞死是否有修復作用。結果顯示造模后各組骨密度檢測結果大致相同，干預后4、8周三組骨密度呈下降趨勢，但對照組下降幅度大，與髓芯減壓組、ADSCs組比較差異明顯（P < 0.05），而髓芯減壓組與ADSCs組相比較差異不明顯（P > 0.05）。在大體及X線表現(xiàn)方面，對照組股骨頭密度降低、囊性變，4、8周后逐漸變扁塌陷，而髓芯減壓組及ADSCs組從干預后4、8周見股骨頭密度降低、囊性變，股骨頭欠光滑，但未見塌陷變扁，較髓芯減壓組，ADSCs組股骨頭軟骨剝離程度較小。HE染色可見對照組隨病程進展，骨陷窩逐漸增多，骨小梁稀疏進而斷裂，而髓芯減壓組及ADSCs組從干預后4、8周骨陷窩少并且見新生骨細胞，骨小梁逐漸增多變粗并趨向成熟，并且較髓芯減壓組，ADSCs組骨小梁排列更整齊飽滿。ADSCs來源于中胚層，與骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化潛能無明顯區(qū)別[18]，并且ADSCs具有取材簡單，來源豐富，并具有較強的體外擴增、低衰減特性等優(yōu)點，不存在倫理爭議等[19]，ADSCs更適合作為細胞療法的種子細胞。關節(jié)穿刺腔內(nèi)局部用藥是臨床上常用的治療骨關節(jié)疾病的方法，其具有操作簡單、迅速起效、高藥物利用度及全身不良反應發(fā)生率低等特點[20]。通過簡單的關節(jié)穿刺注射方法移植ADSCs，經(jīng)關節(jié)腔局部吸收，ADSCs在壞死股骨頭區(qū)通過成骨分化、分泌相關細胞因子達到促進血管生成，改善局部血運，修復骨壞死的效果[21]。BMP為骨的發(fā)生與修復重要的成骨誘導因子，在骨的形成中發(fā)揮著重要作用，而BMP-2為其重要的一員[22]。從實驗結果可以得出，經(jīng)關節(jié)穿刺注射ADSCs可通過上調(diào)BMP促進壞死骨組織的修復，但其機制需進一步探討。

綜上所述，經(jīng)關節(jié)穿刺注射移植ADSCs對激素性股骨頭缺血性壞死有修復作用，可達到髓芯減壓的修復效果，但其遠期療效未知。經(jīng)關節(jié)穿刺注射經(jīng)轉(zhuǎn)染或復合的ADSCs能否對SAFNH達到更好的修復效果，值得進一步研究。

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（收稿日期：2017-11-08 本文編輯：任 念）