高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定多種食品基質(zhì)中的黃曲霉毒素

徐瀟穎， 劉 柱， 朱炳祺， 梁晶晶， 陳萬勤， 羅金文

(浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052)

黃曲霉毒素(Aflatoxins,AFT)是一種由黃曲霉和寄生曲霉等真菌經(jīng)過聚酮途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[1]，常見于發(fā)霉的糧食和其他富含有機物的霉變物體表面。天然產(chǎn)生的AFT中較為常見的有AFT B1、B2、G1、G2和M1[2]。其中，AFT B1毒性最強，是氰化物的10倍，砒霜的68倍[4]，且具有很強的致突變、致畸和致癌作用，被世界衛(wèi)生組織確定為1A級危險物。因此，世界各國都對進口農(nóng)產(chǎn)品和食品中的AFT的最大允許限量(MRL)做出嚴(yán)格規(guī)定[4]。對于樣品基質(zhì)中的AFT，一般先利用溶劑對目標(biāo)物進行萃取，而后進一步對提取液進行凈化，以減少雜質(zhì)含量，排除基質(zhì)對分離和檢測的干擾。王巖松等[5]將Oasis HLB萃取小柱用到谷物中AFT B1、B2、G1、G2和M1的凈化，平均回收率在74.6%～89.6%之間；吳燕等[6]利用MycosepTM226多功能凈化柱對食品中AFT凈化富集，回收率可達到86.7%～97.2%；Taherimaslak等[7]則利用磁性Fe3O4納米粒子鍵合三甲氧基硅烷作為固相萃取劑，對牛奶中AFT M1進行檢測。而免疫親和層析主要是基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，因此具有較高的靈敏度和良好的特異性，是目前我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的方法之一。

目前AFT檢測方法常見的為薄層色譜法[8]、液相色譜法[0 - 10]以及液-質(zhì)聯(lián)用法[11 - 12]。采用液-質(zhì)聯(lián)用法檢測AFT，不僅具有高的靈敏度，同時可以使前處理更簡單，實現(xiàn)多組分同時分析。本文通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對不同食品基質(zhì)中的AFT進行測定，考察不同基質(zhì)及不同凈化方式對AFT回收率的影響，為不同基質(zhì)中AFT測定時凈化方式的選擇提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

XR30AD液相色譜儀(日本，Shimadzu公司)；QTrap5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，AB SCIEX公司)；Keference Skit Milli-Q超純水器(美國，Millipore公司)；Turbo Vap LV氮氣吹干儀(Biotage(上海)有限公司)；QT-1渦旋混合器(上海琪特公司)；Seven Excellerce酸度計(瑞士,Mettler Toledo公司)。

黃曲霉毒素(AFT)B1、B2、G1、G2均購自美國Supelco公司：其中B1、G1的濃度為1 μg/mL，B2、G2的濃度為0.3 μg/mL。AFT B1、B2、G1和G2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 mL于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，充分振蕩混勻后得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。黃曲霉毒素B1-13C17購自英國Biopure公司；甲醇、乙腈(德國Merck公司)和甲酸(美國Fluka公司)均為色譜醇；多壁碳納米管(MWCNTs)(純度>97%，直徑20～40 nm，長度>5 μm；深圳市納米港科技有限公司)，磁性碳納米管(mMWCNTs)制備過程為利用濃HNO3羧化后磁化[13]。實驗過程中用水為超純水儀制得。

1.2 儀器條件

1.2.1色譜條件色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱 (50×2.1 mm，1.7 μm)；流速：0.35 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL；流動相(A)為甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)；(B)為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，15%B；1～7 min，15%～80%B；7～10 min，80%～15%B。

1.2.2質(zhì)譜條件離子源:電噴霧離子源，正離子掃描；掃描方式:多重反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓:5 500 V；離子源溫度:500 ℃；氣簾氣流速:30 L/min；碰撞氣流量:5 L/min；化合物定性離子對、定量離子對、錐孔電壓、碰撞能見表1。

表1 MRM模式下黃曲霉毒素的質(zhì)譜條件

1.3 樣品前處理

1.3.1提取準(zhǔn)確稱取經(jīng)過充分粉碎均勻的試樣5.0 g，置于50 mL具塞塑料離心管中，精確移取40 mL乙腈∶水=80∶20(V/V)，充分振蕩混勻3 min，10 000 r/min離心5 min。

1.3.2凈化免疫親和柱和Waters Oasis HLB固相萃取(SPE)柱凈化：取上述提取液3.0 mL于50 mL塑料離心管中，加入純水至40 mL，以4～5 mL/min的速度全部通過免疫親和柱，抽真空30 s。然后準(zhǔn)確加入4.0 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于5 mL玻璃試管中，用氮氣吹至近干。準(zhǔn)確加入1.0 mL初始比例流動相，充分振搖混勻30 s，轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中，待測。多功能凈化柱Mycosep-226和Mycosep-228：移取8～10 mL提取液通過多功能凈化柱后，精確移取3.0mL濾液至5 mL玻璃試管中，用氮氣吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL初始比例流動相，充分振搖混勻30 s，轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中，待測。Oasis Prime-HLB SPE柱凈化：準(zhǔn)確移取5～6 mL提取液，直接通過Prime-HLB SPE柱，收集濾液于5 mL玻璃試管中，準(zhǔn)確移取3.0 mL濾液用氮氣吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL初始比例流動相，充分振搖混勻30 s，轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中，待測。磁性碳納米管凈化：取上述提取液3.0 mL于50 mL塑料離心管中，加入純水至40 mL后，加入一定量磁性碳納米管，超聲1 min后，渦旋提取30 min，用磁鐵吸附磁性碳納米管，除去上清液。再加入2 mL 甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)的洗脫溶液，超聲1 min后，渦旋30 min后，收集洗脫液于5 mL玻璃試管中，用氮氣吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL初始比例流動相，充分振搖混勻30 s，轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中，待測。

1.4 加標(biāo)回收和精密度實驗

向未檢出AFT B1、B2、G1和G2的大米樣品中，分別加入0.1、0.2、0.5 mL 3個濃度水平的AFT(0.1 μg/mL 的AFT B1、G1和0.03 μg/mL的AFT B2、G2)標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到AFT B1、G1濃度為2.0、4.0、10.0 μg/kg，AFT B2、G2濃度為0.6、1.2、3.0 μg/kg的加標(biāo)試樣，進行加標(biāo)回收試驗，每個濃度3份平行，計算加標(biāo)回收率和精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性碳納米管凈化條件的優(yōu)化

實驗對磁性碳納米管的投加量、提取溶劑以及洗脫溶劑進行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20、40、60、80 mg 4個不同添加量下，目標(biāo)物的回收率并無顯著變化，故確定20 mg為磁性碳納米管投加量；在酸性(pH=4.0)條件下進行提取，堿性(pH=12.0)有機溶劑進行洗脫可以獲得較好的回收率，回收率在60.3%～67.6%之間。而使用AFT B1-13C17進行內(nèi)標(biāo)法計算后，回收率可達到95%以上。相比于傳統(tǒng)的SPE柱凈化，磁性碳納米管成本較低，提取、凈化過程操作也簡便。

2.2 不同凈化方式下黃曲霉毒素的回收率與精密度

以大米為基質(zhì)，分別采用多功能凈化柱Mycosep-226、Mycosep-228、免疫親和柱、Waters Oasis HLB SPE小柱、Oasis Prime-HLB SPE柱、磁性碳納米管6種凈化方式，考察三個加標(biāo)濃度水平下的黃曲霉毒素的回收率，結(jié)果如圖1。在6種凈化方式中，免疫親和柱在4種黃曲霉毒素的三個濃度水平下的回收率在95.2%～102.8%之間，要優(yōu)于其它幾種凈化方式。主要是由于免疫親和柱利用了抗體對毒素的特異性吸附，所以能專一性吸附提取液中的黃曲霉毒素。而在6種凈化方式中，mMWCNTs凈化方式雖然已進行優(yōu)化，但回收率依然只有60.3%～67.6%，主要是目標(biāo)物在提取過程中未像填充柱可進行多次交換吸附，造成了部分目標(biāo)物在提取過程中的損失，但此方法成本低且操作過程相較于其他柱凈化無需嚴(yán)格控制過柱速率。

圖1 不同凈化方式下黃曲霉毒素的回收率與精密度Fig.1 Recovery and precision of aflatoxin under different purification methods

2.3 不同基質(zhì)中黃曲霉毒素的回收率與精密度

分別在玉米粉、大米及食用油中進行相同水平加標(biāo)后進行回收率測定，結(jié)果如表2。在不同基質(zhì)中，6種凈化方式所測得的回收率大體呈相同趨勢，其中都以免疫親和柱最佳，回收率在86.1%～102.8%之間，Prime-HLB采用通過式凈化技術(shù)也能夠獲得較好回收，而磁性碳納米管回收率在58.4%～66.2%之間，但采用內(nèi)標(biāo)法后該方法仍可對黃曲霉毒素進行有效測定。而對于不同的基質(zhì)，食用油中黃曲霉毒素的測定回收率要低于另兩種基質(zhì)，考慮油中存在脂類物質(zhì)，對柱回收存在影響，因此相比于免疫親和柱，通過式的Prime-HLB、多功能凈化柱Mycosep-226、Mycosep-228的回收率差異較小。從不同黃曲霉毒素方面分析，Mycosep-226對AFT G2的回收效果要優(yōu)于其它3種黃曲霉毒素；而免疫親和柱及Prime-HLB對不同黃曲霉毒素回收效果相近，在同時測定4種黃曲霉毒素時可選用這兩種凈化柱。

表2 不同基質(zhì)中黃曲霉毒素的回收率與精密度(n=3)

2.4 不同基質(zhì)中黃曲霉毒素的基質(zhì)效應(yīng)

圖2 不同基質(zhì)中黃曲霉毒素的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects on detection of aflatoxin in different substrates

液相色譜具有較好的特異性，但越來越多的數(shù)據(jù)表明液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜普遍存在基質(zhì)效應(yīng)[14]。本文中選擇Prime-HLB進行凈化處理后，按照Matuszewski等[15]的建議，比較基質(zhì)效應(yīng)(ME)=不同來源的樣品基質(zhì)提取后添加/純標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用中濃度點加標(biāo)條件，每個樣品進行5次平行測定，實驗結(jié)果如圖2。以大米、玉米粉及食用油為基質(zhì)的ME<100%，說明三者對黃曲霉毒素均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，其中大米與玉米粉的基質(zhì)抑制效應(yīng)較小，分別在89.4%～93.9%、82.0%～92.5%，而食用油的基質(zhì)效應(yīng)76.1%～90.4%。主要是由于食用油中存在磷脂，磷脂對電噴霧電離產(chǎn)生離子抑制作用[16]。一般對基質(zhì)效應(yīng)的消除多采用同位素內(nèi)標(biāo)法，該方法不但可抵消質(zhì)譜離子化時的基質(zhì)效應(yīng)，還可以消除前處理過程中的差異。

3 結(jié)論

本實驗探索黃曲霉毒素凈化的新方法，比較6種凈化方式對黃曲霉毒素的回收效果，發(fā)現(xiàn)免疫親和柱利用抗原抗體的特異性吸附作用，在不同基質(zhì)及不同加標(biāo)水平下獲得的回收率都高于其他5種凈化方式；磁性碳納米管作為凈化新方法，其絕對回收率在58.4%～66.2%，而加入內(nèi)標(biāo)進行回收率計算時，則回收率可達到90%以上，該方法較其它柱凈化方式具有成本低和操作簡便的優(yōu)勢。而不同基質(zhì)中黃曲霉毒素存在的基質(zhì)抑制效應(yīng)也是影響液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確測定黃曲霉毒素因素之一。

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