改進(jìn)QuEChERS-氣相色譜/質(zhì)譜法測(cè)定食源性植物中煙堿及次要生物堿

張洪非， 羅彥波， 李翔宇， 姜興益， 朱風(fēng)鵬， 龐永強(qiáng)陳 歡， 韓書磊， 付亞寧， 劉 彤， 侯宏衛(wèi)

(國(guó)家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南鄭州 450001)

生物堿是植物的次生代謝產(chǎn)物，約四分之一的植物都會(huì)產(chǎn)生生物堿[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在馬鈴薯，西紅柿、茄子和辣椒中能檢測(cè)到低水平的煙堿含量(10 μg/kg以下)[2 - 9]。除了煙堿外的其它生物堿叫做次要生物堿，如降煙堿、新煙草堿、假木賊堿、麥斯明、可替寧、2,3′-二吡啶、3,3′-二吡啶、二烯煙堿、N-甲基假木賊堿、二烯降煙堿等。其中，降煙堿、新煙草堿和假木賊堿的含量相對(duì)較高，研究也最多[6]。次要生物堿在煙草中廣泛分布，但在西紅柿、土豆等食物中未檢出煙堿之外的其他生物堿[7]。

煙草中主要生物堿的測(cè)定大多采用氣相色譜法(GC)[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)[10 - 11]，應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)分離測(cè)定煙草中生物堿的報(bào)道較少[12 - 13]，毛細(xì)管電泳分析的方法也有報(bào)道[14]。目前未見食源性植物中次要生物堿的檢測(cè)方法報(bào)道。《煙草及煙草制品 煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明和假木賊堿的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》(YC/T383-2010)針對(duì)煙草產(chǎn)品開發(fā)了檢測(cè)方法，由于煙堿在煙草中的含量達(dá)到3%，因此對(duì)于生物堿含量較低的西紅柿和茄子等不能檢測(cè)。同時(shí)由于茶葉、牛肝菌等樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，含有色素較多，因此需要優(yōu)化凈化步驟。

QuEChERS的樣品前處理技術(shù)[15]在植物檢測(cè)中廣泛應(yīng)用，但當(dāng)其應(yīng)用于沸點(diǎn)低的萃取溶劑時(shí)易導(dǎo)致發(fā)熱量太大從而影響目標(biāo)物的測(cè)定結(jié)果。為了驗(yàn)證食源性植物(牛肝菌、茶葉、馬鈴薯，番茄，茄子和甜辣椒等)中煙堿及次要生物堿是否由污染產(chǎn)生，以及評(píng)估從膳食暴露攝入煙堿及次要生物堿的潛在風(fēng)險(xiǎn)，本研究采用改進(jìn)QuEChERS-氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法(GC/MS)，測(cè)定上述食源性植物中煙堿和次要生物堿及其含量分布。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

6890N氣相色譜/5975B質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)，Agilent公司)；PAS凈化試劑包(美國(guó)，Agilent公司)。

煙堿、降煙堿與可替寧儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取約15.0 mg煙堿及可替寧、降煙堿，置于3個(gè)25 mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。麥斯明儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取約10.0 mg麥斯明，置于25 mL的棕色容量瓶中，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。假木賊堿和新煙堿混標(biāo)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取約15.0 mg假木賊堿、10.0 mg新煙堿，置于25 mL的棕色容量瓶中，加入約10 mL萃取溶液完全溶解后，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。麥斯明、可替寧、假木賊堿和新煙堿的混和標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取0.02、0.05、0.10、0.25、0.50、1.0 mL的麥斯明、可替寧、假木賊堿和新煙堿混標(biāo)儲(chǔ)備液于不同的10 mL棕色容量瓶中，再準(zhǔn)確加入200 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。內(nèi)標(biāo)2-甲基喹啉溶液：800 μg/mL。煙堿、降煙堿標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取0.02、0.05、0.10、0.25、0.50 mL的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL棕色容量瓶中，再準(zhǔn)確加入200 μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液稀釋定容至刻度。6種目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)2-甲基喹啉均購自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。甲基叔丁基醚、乙腈、三氯甲烷(色譜純，韓國(guó)德山化工有限公司)。所用水由Milli-Q系統(tǒng)(Milford,MA,USA)制得。

1.2 儀器條件

GC/MS條件：色譜柱為DB-35 ms柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫箱程序：初始溫度100 ℃，保持3.0 min，再以8 ℃/min升至260 ℃，保持10 min，總運(yùn)行時(shí)間：33 min。進(jìn)樣量3 μL;分流進(jìn)樣，分流比為：5∶1；高純He為載氣；接口和離子源溫度為300 ℃和200 ℃；電離源為EI源；電離能量70 eV；溶劑延遲時(shí)間8 min；目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式參數(shù)如表1所示。

表1 目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)的SIM參數(shù)和保留時(shí)間

1.3 樣品制備

稱取2.0 g已粉碎的樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入2.0 mL 10%的NaOH溶液浸潤(rùn)樣品，靜置10 min。取10 mL 0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚到離心管中，加入200 μL 2-甲基喹啉內(nèi)標(biāo)溶液，于旋渦混合器上以2 000 r/min振蕩1 min。移取1.0 mL上清液于2 mL凈化離心管中(內(nèi)含150 mg無水MgSO4，25 mg PSA吸附劑，7.5 mg GCB吸附劑)，于旋渦混合器上以2 000 r/min振蕩2 min，以5 000 r/min離心3 min。取上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜后，進(jìn)行GC-MS檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取方式的選擇

本研究考察了QuEChERS技術(shù)的高速渦旋振蕩提取及超聲提取，結(jié)果顯示采用渦旋振蕩提取結(jié)果均高于超聲提取(圖1)，因此最終選擇渦旋振蕩的萃取方式。

2.2 萃取溶劑的選擇

本研究?jī)?yōu)化了萃取溶劑。當(dāng)使用正己烷等非極性溶劑做萃取劑時(shí)，樣品提取液中的極性共萃取基質(zhì)較少，但對(duì)煙堿等目標(biāo)物的萃取效率較差。常用的溶劑中，丙酮萃取的雜質(zhì)較多，而且對(duì)MgSO4具有一定的溶解性，溶液中含鹽對(duì)色譜柱不利；乙酸乙酯對(duì)部分極性目標(biāo)物萃取效率不高；乙腈作為QuEChERS前處理方法中的一種通用極性溶劑，可同時(shí)萃取極性和非極性目標(biāo)物，而且有利于下一步的凈化。同時(shí)還考察了三氯甲烷及甲基叔丁基醚的萃取效率。結(jié)果表明，甲基叔丁基醚與三氯甲烷的萃取效率比較接近，乙腈稍低，實(shí)驗(yàn)選擇甲基叔丁基醚作為萃取溶劑。

2.3 緩沖體系的選擇

圖1 不同提取方式的提取效果Fig.1 Extraction efficiency of different extraction modes

Anastassiades等[15]提出了適用于水果和蔬菜的多殘留分析方法，該方法發(fā)展迅速，并不斷改進(jìn)以適用于不同的目標(biāo)物，但原方法對(duì)堿敏感的目標(biāo)物會(huì)受基質(zhì)影響而使回收率變差。Anastassiades等后來采用加入檸檬酸鹽的方法以獲得穩(wěn)定的pH，該方法被歐盟認(rèn)可為標(biāo)準(zhǔn)方法(EN 15662)[16]。本研究考察了檸檬酸緩沖鹽體系在食源性樣品基質(zhì)中的提取效率。檸檬酸緩沖鹽體系為：4 g無水MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3Cit·2H2O+0.5 g Na2HCit·1.5H2O。這個(gè)體系樣品基質(zhì)的pH值為5.0～5.5，而本研究的目標(biāo)物為煙堿類物質(zhì)，需要在堿性條件下才能游離出來；同時(shí)測(cè)定了樣品不加緩沖鹽試劑包的pH為9.0，加入緩沖鹽試劑包的pH在7.0左右，不利于目標(biāo)物的游離。另外，由于緩沖鹽試劑包中含有4 g MgSO4，在吸水的同時(shí)釋放了大量的熱量，使溶劑溫度達(dá)到55 ℃，由于甲基叔丁基醚的沸點(diǎn)為55.2 ℃，因此可以明顯觀察到溶液的沸騰，這樣會(huì)使溶劑和目標(biāo)物造成了損失，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這個(gè)現(xiàn)象。如圖2所示，以未加緩沖鹽體系的樣品中目標(biāo)物結(jié)果進(jìn)行歸一化，發(fā)現(xiàn)加入緩沖鹽試劑包的結(jié)果偏低，尤其對(duì)于麥斯明，結(jié)果偏低50%左右。因此，本方法對(duì)QuEChERS法進(jìn)行改進(jìn)，采用不加緩沖鹽試劑包而采用渦旋振蕩的萃取方法。

2.4 凈化吸附劑的選擇

圖2 目標(biāo)分析物在緩沖體系中的回收率Fig.2 Recovery of the analyte in buffer system

在QuEChERS前處理方法中，常用的凈化劑有PSA、C18、GCB等。其中，PSA可除去提取液中的碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類和少量的色素；C18可去除脂肪和酚類化合物；GCB主要用于除色素?；|(zhì)中的主要干擾物為脂肪酸、有機(jī)酸、碳水化合物、甾醇等極性干擾物，而PSA作為弱陰離子交換吸附劑，對(duì)于上述極性干擾物的吸附提供最好的凈化效果。水分含量對(duì)PSA的凈化效果有著至關(guān)重要的作用，水分含量越低，PSA的凈化效果越好。并且無水MgSO4的除水效果要好于Na2SO4。因此在PSA中添加C18和/或GCB，考察不同凈化劑組合對(duì)提取液的凈化效率及對(duì)目標(biāo)物的吸附效應(yīng)，目標(biāo)物在不同凈化劑作用下的回收率見圖3。從結(jié)果來看，最終選擇High pigment(25 mg PSA+7.5 mg GCB+150 mg MgSO4(每mL提取液))作為凈化劑。

圖3 三種PSA的凈化效果Fig.3 Clean-up effect of 3 PSA

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

圖4 6種目標(biāo)物在3種不同提取液中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of 6 analytes in three different extracts

與液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)主要來自于離子源不同，氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜的基質(zhì)效應(yīng)主要來自氣相部分，而且以基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)為主。減小基質(zhì)效應(yīng)應(yīng)用最多的是用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正。三個(gè)樣品基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行配制，通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的信號(hào)差異來考察三種不同的前處理方法得到的萃取液中目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)。6種目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)見圖4。由圖4可知，大部分目標(biāo)物在提取液中均呈現(xiàn)顯著的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。三種基質(zhì)中，牛肝菌提取液的基質(zhì)效應(yīng)最強(qiáng)(對(duì)幾種不同種類的目標(biāo)物都是如此)，表明其基質(zhì)含量最大；而西紅柿萃取液基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較弱。因此，本研究采用加入和目標(biāo)物結(jié)構(gòu)類似的2-甲基喹啉作為內(nèi)標(biāo)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正。

2.6 方法確認(rèn)

在優(yōu)化條件下，考察了方法的檢出限(S/N=3)、定量限(S/N=10)、線性范圍和重現(xiàn)性。分別以目標(biāo)物濃度及其峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫、縱坐標(biāo)繪制工作曲線。如表2所示，6種目標(biāo)物的檢出限在0.06～0.18 mg/kg之間，定量限在0.07～0.60 mg/kg之間，線性相關(guān)系數(shù)R2≥0.993。

表2 目標(biāo)物的線性范圍、工作曲線、檢出限和定量限

將牛肝菌、茶葉和西紅柿3種樣品加標(biāo)后用本方法測(cè)定，如表3所示，目標(biāo)物的平均回收率在84.1%～109.1%之間。為了考察本方法的重現(xiàn)性，對(duì)3種濃度的樣品，以1 d內(nèi)5次平行測(cè)定，及連續(xù)3 d測(cè)定，計(jì)算日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。如表4所示，目標(biāo)物的日內(nèi)及日間精密度分別小于9.4%和8.2%，其中目標(biāo)物在中濃度和高濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值不高于8.4%，低濃度下的日內(nèi)及日間精密度數(shù)值略高。

表3 實(shí)際樣品中目標(biāo)物的回收率

表4 目標(biāo)物在不同濃度下的精密度

2.7 實(shí)際樣品分析

為了驗(yàn)證本方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果，采用本方法處理16個(gè)茶葉樣品、6個(gè)牛肝菌樣品、3個(gè)西紅柿樣品、1個(gè)土豆樣品、1個(gè)茄子樣品和1個(gè)辣椒樣品并進(jìn)行測(cè)定。6個(gè)牛肝菌樣品中煙堿、降煙堿、假木賊堿和可替寧均有檢出，麥斯明檢出率16.7%；新煙堿均未檢出，見表5。16個(gè)茶葉樣品中煙堿、降煙堿、假木賊堿和可替寧均有檢出；麥斯明檢出率25%；新煙堿均未檢出。3個(gè)西紅柿樣品中煙堿均有檢出；同樣降煙堿、假木賊堿、麥斯明、新煙堿和可替寧也全部有檢出，含量略有不同，其中可替寧含量最高，新煙堿含量最低。土豆和茄子樣品中煙堿均有檢出，含量分布在1.20～1.60 mg/kg之間；同樣降煙堿、假木賊堿和麥斯明也全部有檢出，含量略有不同，新煙堿和可替寧均未檢出。辣椒樣品煙堿、降煙堿、假木賊堿、麥斯明和新煙堿也有檢出，含量和土豆、茄子一致；可替寧未檢出。

表5 檢測(cè)樣品目標(biāo)物含量(mg/kg)

"-" not detected.

通過與文獻(xiàn)方法[17 - 19]比較，發(fā)現(xiàn)牛肝菌和茶葉中煙堿的數(shù)據(jù)以前未見報(bào)道。西紅柿等茄科植物中的煙堿含量報(bào)道較多，由于前期研究集中在20世紀(jì)90年代，那時(shí)的檢測(cè)條件和現(xiàn)在差異較大，同時(shí)由于所測(cè)定的樣品種屬的不一致，以及樣品成熟度的不一致(含水率不同)，也導(dǎo)致數(shù)據(jù)存在一定的差異性。

3 結(jié)論

采用改進(jìn)QuEChERS方法，以0.01%三乙胺-甲基叔丁基醚溶液對(duì)樣品中的生物堿進(jìn)行渦旋提取，用High pigment PSA對(duì)提取物進(jìn)行凈化，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，建立了食源性植物(牛肝菌、茶葉和西紅柿)中煙堿和5種次要生物堿的檢測(cè)方法。本方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、凈化能力強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。采用本方法處理16個(gè)茶葉樣品、6個(gè)牛肝菌樣品、3個(gè)西紅柿樣品、1個(gè)土豆樣品、1個(gè)茄子樣品和1個(gè)辣椒樣品并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙堿在所有樣品中均有不同程度的檢出，降煙堿、新煙堿、麥斯明、假木賊堿和可替寧在部分樣品中有檢出。

參考文獻(xiàn)：

[1] Lewis D A,York B M Jr.Biochemical Systematics and Ecology,1978,6:61.

[2] Andersson C,Wennstr?m P,Gry J.Tema Nord,2003,531.

[3] Griffin W J.Pharmacy International,1985,6:305.

[4] Halim A F,Collins R P,Berigari M S.Planta Medica,1971,20:44.

[5] Saitoh F,Noma M,Kawashima N.Phytochemistry,1985,24(3):477.

[6] Bindler G,Van H R,Gunduz I.Theoretical and Applied Genetics,2007,114(2):341.

[7] Williams J G,Kubelic A R,Livak K J,et al.Nucleic Acids Research,1990,18:6513.

[8] LIU B Z.Multidimensional Gas Chromatography/mass Spectrometry Analysis of the Chiral Composition of Alkaloids in Tobacco and Cigarette Smoke.Hefei:University of Science and Technology of China(劉百戰(zhàn).煙草和卷煙煙氣中生物堿手性組成的多維氣相色譜/質(zhì)譜分析.合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué))，2009:3.

[9] DING L,SHENG L Q,TONG H W,et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(丁麗,盛良全，童紅武，等.分析化學(xué)),2004,32(09):1161.

[10] Wu W J,Ashley D L,Watson C H.Analytical Chemistry,2002,74:4878.

[11] SU M L.Study on the Composition and Migration of Alkaloids in Tobacco and Cigarettes.Zhengzhou：Zhengzhou Tobacco Research Institute of China National Tobacco Company(蘇明亮.煙葉與卷煙中生物堿組成及其遷移規(guī)律研究.鄭州：中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院),2004:10.

[12] Plade J J,Hoffmann D J.Liquid Chromatography,1980,3(10):1505.

[13] Saunders J A,Blume D E.Journal of Chromatography A,1981,205:147.

[14] Yang S S,Smetena I.Journal of Chromatographia,1995,40(7-8):375.

[15] Anastassiades M,Lehotay S J,Stajnbaher D,Schenck F J.Journal of AOAC International,2003,86(2):412.

[16] BS EN 15662:2008 Foods of Plant Origin-Determination of Pesticide Residues Using GC-MS and/or LC-MS/MS Following Acetonitrile Extraction/Partitioning and Clean-up by Dispersive SPE-QuEChERS.

[17] Castro A,Monji N.Biomedical Research,1986,2:91.

[18] Sheen S J.Journal of Food Science,1988,53:1572.

[19] Davis R A,Stiles M F,Debethizy J D,Reynolds J H.Food and Chemical Toxicology,199129:821.