固相萃取-高效液相色譜法測定大鼠尿樣中調(diào)環(huán)酸鈣

馬安萍， 陳紅紅*， 阮小林， 丘靜靜， 吳邦華

(1.廣東藥科大學公共衛(wèi)生學院，廣東廣州 510310；2.廣東省職業(yè)病防治院，廣東省職業(yè)病防治重點實驗室，廣東廣州 510310)

調(diào)環(huán)酸鈣(Prohexadion-calcium)化學名稱3,5-二氧代-4-丙?；h(huán)己烷羧酸鈣，它是一種新型的環(huán)己酮類植物生長調(diào)節(jié)劑[1 - 2]，具有促進農(nóng)作物生育，提高作物產(chǎn)量，增強植株的抗病害能力以及減輕倒伏等作用[3 - 7]，其純品為無色或白色晶體，原藥外觀為米色或淺黃色無定形固體，易溶于甲醇和水[1]。調(diào)環(huán)酸鈣作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑被廣泛應用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，盡管調(diào)環(huán)酸鈣毒性相對較低，但是若使用不當或者長期接觸仍會對人體造成傷害。目前國內(nèi)外關于調(diào)環(huán)酸鈣的報道多見于其對農(nóng)作物的生長調(diào)控，而關于調(diào)環(huán)酸鈣檢測方法的報道較少[8 - 10]，尤其是生物材料中調(diào)環(huán)酸鈣的檢測未見報道。本實驗通過固相萃取提取凈化尿樣中的調(diào)環(huán)酸鈣，樣品前處理步驟簡單，并通過對高效液相色譜(HPLC)條件的優(yōu)化實現(xiàn)了尿樣中調(diào)環(huán)酸鈣的分離分析。該方法準確度和精密度均能達到生物材料中定量分析的要求，適合于尿樣中調(diào)環(huán)酸鈣的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國，Agilent公司)；AUY220電子天平(日本，島津公司)；固相萃取小柱:Waters OasisMAX( 3cc，美國Waters公司)，Waters OasisHLB(3cc，美國Waters公司),Supelclean LC-SAX 3 mL(上海安普科學儀器有限公司)。

調(diào)環(huán)酸鈣標準品(純度 ≥ 98%)；甲醇為色譜純；甲酸、磷酸均為分析純(廣州化學試劑廠)；實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1標準溶液的配制準確稱取調(diào)環(huán)酸鈣標準品0.0200 g，置于10 mL容量瓶中用7%磷酸-甲醇溶液定容至刻度，得到2.00 mg/mL的標準貯備液。臨用前用甲醇稀釋成100.00 μg/mL標準溶液。

1.2.2樣品前處理Water OasisMAX固相萃取小柱分別用3 mL甲醇和3 mL水依次活化；將尿樣于室溫下緩慢解凍混勻，移取0.50 mL至上述活化好的柱上，在自然重力下過柱。依次用1 mL 10%甲醇水溶液、1 mL甲醇淋洗小柱，負壓抽干2 min；再用2 mL 1%甲酸水溶液-甲醇洗脫至5 mL聚乙烯塑料管，混勻后取待測液1 mL至2 mL進樣瓶中，待測。

1.2.3高效液相色譜條件色譜柱：Agilent-Poroshell 120 EC-C18柱(100×4.6 mm，2.7 μm)；流動相：A相為0.01%甲酸水溶液，B相為甲醇。梯度洗脫；初始90%A、10%B；20 min內(nèi)逐漸變?yōu)?0%A、70%B，保持2 min；25 min逐漸變?yōu)槌跏紬l件并保持3 min；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL；檢測波長：275 nm。在該條件下，調(diào)環(huán)酸鈣標準品的保留時間為18.74 min。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

圖1 尿樣加標色譜圖和空白尿樣的色譜圖Fig.1 Chromatogram of spiked urine and blank urine----:spiked urine;:blank urine.

調(diào)環(huán)酸鈣易溶于甲醇，故實驗選擇甲醇水溶液作為流動相，根據(jù)調(diào)環(huán)酸鈣的結構可知其在尿中多以離子形式存在，在C18色譜柱保留較差，含水流動相中加酸可改變其極性，改善其在色譜柱中的保留情況[2]，因此在水相中加入0.01%的甲酸。在流動相流速為0.4 mL/min的條件下考察不同體積比的甲醇水溶液對尿樣中調(diào)環(huán)酸鈣的分離情況。實驗結果表明采用等度洗脫時，目標組分和內(nèi)源性干擾組分不能完全分離，而在梯度洗脫條件下可以完全分開且無內(nèi)源性干擾，最終確定流動相梯洗條件見1.2節(jié)。優(yōu)化條件下加標尿樣和空白尿樣色譜圖見圖1。

2.2 固相萃取條件的優(yōu)化

2.2.1固相萃取小柱的選擇實驗考察了Water OasisMAX、Water OasisHLB和Supelclean LC-SAX三種不同固相萃取小柱對尿樣中調(diào)環(huán)酸鈣的凈化效果。結果顯示在常規(guī)的淋洗洗脫條件下，MAX柱就能取得相對較好的凈化效率，回收率達到95%左右。而HLB柱回收率低于5%，LC-SAX柱在淋洗過程中，待測物幾乎全部被洗出。綜合以上選擇MAX柱凈化尿樣中的調(diào)環(huán)酸鈣。

2.2.2淋洗液選擇選擇10%、20%甲醇水溶液以及甲醇為淋洗液，實驗發(fā)現(xiàn)在2～3 min內(nèi)洗出雜質(zhì)峰的峰形、響應值以及峰的個數(shù)基本相同，因此選用10%甲醇水溶液和甲醇作為淋洗液。考察淋洗液用量發(fā)現(xiàn)，淋洗液1 mL即可實現(xiàn)待測物與其他物質(zhì)分離，因此選用1 mL的淋洗液。

2.2.3洗脫溶劑的選擇選擇1%甲酸-甲醇溶液，利用溶液中高濃度的甲酸根離子將陰離子柱上分析物通過離子交換洗脫下來。對不同濃度甲酸-甲醇溶液的洗脫效果進行考察，結果表明隨著洗脫液中甲酸濃度的增加，回收率逐漸增高，當甲酸的濃度增加到1%時，回收率最高，因此洗脫液選擇1%甲酸-甲醇溶液。進一步實驗發(fā)現(xiàn)2 mL洗脫液可將待測物全部洗出，回收率達95%，故選擇洗脫液的用量為2 mL。

2.3 線性范圍及檢出限

取6只具塞聚乙烯塑料管，分別加入0、1 、2.5、10、25、50 μL的標準溶液，每管各加入0.5 mL的尿樣，配成標準系列溶液。采用實驗方法以調(diào)環(huán)酸鈣的濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制工作曲線，其回歸方程為：Y=0.004565X+0.5507，本方法檢測尿樣中調(diào)環(huán)酸鈣的質(zhì)量濃度在0.20～5.00 μg/mL范圍呈線性關系，相關系數(shù)R2=0.999，檢出限為0.06 μg/mL，定量限為0.10 μg/mL。

2.4 精密度和回收率的考察

取低、中、高(0.60、2.00、3.50 μg/mL) 3個濃度的加標尿樣，按照上述前處理方法處理，HPLC法測定。日內(nèi)精密度(RSD)分別為3.89%、2.14%和2.86%。日間RSD分別為6.67%、7.58%和5.01%。大鼠尿樣中分別加入低、中、高(0.60、2.00、3.50 μg/mL) 3個濃度的調(diào)環(huán)酸鈣溶液，按照上述方法處理和測定，考察方法的回收率，回收率分別為104.94%、103.41%和96.41%。

2.5 方法應用

在大鼠飼料中添加一定質(zhì)量調(diào)環(huán)酸鈣原藥(10 μg/mL)，并給3只行為無異常且體重相近(約400 g)的大鼠喂食，分別在其染毒后的第2、6、12、24、48、72、96、120 h收集尿樣，用本方法進行測定，結果見表1。

表1 實際樣品測定結果(n=3)

-：not detected.

3 結論

本文建立的尿樣中調(diào)環(huán)酸鈣的測定方法具有靈敏度高、精密度好、樣品前處理簡單的特點，方法的各項指標均符合國家標準(GBZ/T 210.5-2008)《職業(yè)衛(wèi)生標準制定指南第五部分：生物材料中化學物質(zhì)測定方法》的要求，適用于尿中調(diào)環(huán)酸鈣的定量檢測。

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