微反應(yīng)器在酶催化合成哌啶甲酸中的研究

張 瑞， 曹 遜， 應(yīng)晗笑， 劉澤蒙， 陳可泉

（南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816）

哌啶甲酸（Pipecolic acid，簡稱PA）是一種剛性環(huán)狀非蛋白質(zhì)氨基酸，可以作為多種化合物合成庫中的多功能骨架[1]。哌啶甲酸或其衍生物可以廣泛用作許多手性藥物和生物活性物質(zhì)的合成中間體[2]，如抗癌藥物雷帕霉素、局麻藥物布比卡因、新一代抗生素山卓霉素、抗HIV藥物斑莢素以及抗抑郁藥物哌苯甲醇等[3]。由于哌啶甲酸及其衍生物獨(dú)特的生物性能和重要的利用價(jià)值[4]，其合成制備引起了國內(nèi)外越來越多的研究者的關(guān)注[5]。

目前，哌啶甲酸的合成方法主要有化學(xué)不對稱合成、光催化合成以及生物催化合成三種方法[6-8]。其中化學(xué)合成法步驟比較繁瑣，且過程中會(huì)產(chǎn)生一些對環(huán)境有毒害的副產(chǎn)物[9]。光催化合成對催化條件和反應(yīng)器的要求比較苛刻，反應(yīng)過程難以控制[10]。酶法合成相比非生物催化劑具有高效性、專一性等特點(diǎn)，使得生物合成法相比其他方法更加環(huán)保、高效[11]。

微流控技術(shù)是在微尺寸的條件下對復(fù)雜流體進(jìn)行控制、操作和檢測的新興技術(shù)[12-14]。相比于在搖瓶或其他反應(yīng)器[15]，流體在微納尺度下，流體間的傳質(zhì)、傳熱[16]和反應(yīng)過程變得高效、易控[17]，極大提高了反應(yīng)的可控性[18]。利用這一優(yōu)勢，微流控技術(shù)已逐漸應(yīng)用于生物催化中[19-21]。Kundu等在微通道中用酶催化ε-己內(nèi)酰胺合成聚己內(nèi)酯，快速合成了大分子聚己內(nèi)酯[22]。Kanno等在PDMS微通道中用β糖苷酶水解PNPGal，比試管中進(jìn)行的反應(yīng)速率加快了5倍[23]。Heider等用組合式微反應(yīng)器合成小分子藥物阿利吉侖，達(dá)到41 g/L的高產(chǎn)量[24]。

作者采用賴氨酸環(huán)化脫氨酶（Lysine cyclodeaminase，簡稱 LCD）催化 L-賴氨酸生成 L-哌啶甲酸[25]，見圖1。在催化過程中底物進(jìn)入酶活性中心較慢，采用自制PDMS微芯片作為反應(yīng)器強(qiáng)化傳質(zhì)，提高反應(yīng)速率。

圖1 L-賴氨酸經(jīng)LCD制備L-哌啶甲酸工藝Fig.1 Conversion of L-lysine to L-pipecolic acid by LCD

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

聚二甲基硅氧烷 （PDMS）聚合物前體及固化劑：購于蘇州文灝科技有限公司；L-賴氨酸：購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-高脯氨酸：購于阿拉??；NaCl、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等：購于南京晚晴化玻有限公司。

IKA CVC 3000真空壓力泵進(jìn)行PDMS脫氣，GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱進(jìn)行PDMS的固化，LSP02-1B雙通道注射泵用于微芯片反應(yīng)，Alltech Series 1500高效液相色譜用于組分檢測。

1.2 賴氨酸環(huán)化脫氨酶的培養(yǎng)方法

LB液體培養(yǎng)基包含蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，一定濃度的氨芐抗生素。種子培養(yǎng)方法是先將含有pipA基因的E.coli工程菌株接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，加入10 μL的氨芐抗生素。置于37℃搖床，轉(zhuǎn)速200r/min過夜培養(yǎng)。將種子液用于發(fā)酵培養(yǎng)，在500 mL的搖瓶中接種1 mL上述種子液于100 mL的LB液體培養(yǎng)基中，加入200μL 的氨芐抗生素培養(yǎng) 2.5～3 h，在 OD600值達(dá)到0.6時(shí)加入IPTG，于30℃搖床中誘導(dǎo)表達(dá)6 h。

1.3 賴氨酸環(huán)化脫氨酶粗酶液制取

將誘導(dǎo)后的發(fā)酵液在4℃、5 000 r/min離心5 min收集菌體。加入40 mL、pH 7.0 PBS緩沖液進(jìn)行重懸菌體洗滌，再以相同條件離心。洗滌兩次后，將菌體重懸于1/10體積的pH 7.0 PBS緩沖液超聲破碎，超聲破碎功率150 W、時(shí)間20 min、時(shí)間間隔（工作時(shí)間∶間歇時(shí)間）2∶2（s/s）。 超聲破碎結(jié)束后的渾濁液10 000 r/min離心10 min，收集上清液，即獲得賴氨酸環(huán)化脫氨酶粗酶液。

1.4 Bradford考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度

取兩支干凈的試管，一支加入PBS緩沖液1 mL及Bradford 4 mL，作為空白組。另一支加入稀釋到合適濃度的酶液1 mL及Bradford 4 mL，混勻并室溫靜置5 min，用紫外分光光度計(jì)測定樣品在595 nm下的吸光度值，得到樣品中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.5 L-賴氨酸和L-哌啶甲酸測定

使用高效液相色譜進(jìn)行含量測定。色譜柱為C18 分析柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）。 流動(dòng)相 A 為7 mL/L三氟乙酸和5 mmol/L七氟丁酸的水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。進(jìn)樣體積10 μL，柱溫30℃，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。檢測器溫度115℃，使用自動(dòng)空氣發(fā)生器作為氣源，空氣流速3 L/min。

1.6 微芯片制作

微流控芯片的結(jié)構(gòu)見圖2a。制作PDMS芯片的模具由蘇州文灝芯片科技有限公司制作。本次制作的 “S”型通道總長度為31.2 cm，尺寸為200～400 μm，通道深寬比為 1∶1。

硅片模具上的光刻膠易脫落，因此使用甲基硅氧烷對硅片模具進(jìn)行表面修飾。將硅片模具放入玻璃揮發(fā)缸中，滴入甲基硅氧烷2～3滴，使其揮發(fā)修飾3 min。

將PDMS聚合物前體和固化劑按質(zhì)量比10∶1混合后充分?jǐn)嚢瑁糜谧灾频男⌒兔荛]容器中，使用真空泵抽氣。利用狹小空間實(shí)現(xiàn)快速脫氣，除去混合物中的氣泡，這個(gè)過程需要20～30 min，比常用的脫氣裝置縮短了大量時(shí)間。脫氣完成后將其小心澆注在硅片模具上，于80℃烘箱靜置20 min。整個(gè)過程需要大約1 h。待PDMS固化后將其小心剝離，豎直打孔后，再與另一塊平整的PDMS貼合，于60℃烘箱靜置3 h完成鍵合。

1.7 搖管中進(jìn)行賴氨酸環(huán)化脫氨酶的催化

向磷酸鹽緩沖液中加入賴氨酸，使其質(zhì)量濃度為10 g/L，再加入粗酶液至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度1 g/L和一定量的NAD+與Fe2+，用乙酸調(diào)節(jié)體系pH到實(shí)驗(yàn)所需，配制成賴氨酸環(huán)化脫氨酶催化反應(yīng)體系。

向10 mL搖管中加入反應(yīng)液，放置在恒溫振蕩搖床中，轉(zhuǎn)速250 r/min進(jìn)行催化反應(yīng)。

1.8 在微芯片中進(jìn)行賴氨酸環(huán)化脫氨酶的催化

反應(yīng)體系與1.7所述相同。用注射器吸取反應(yīng)液，排出注射器前端空氣，然后固定在注射泵上。用硅膠導(dǎo)管連接注射器、微芯片和反應(yīng)液收集管。通過調(diào)節(jié)注射泵的注射速度控制反應(yīng)液流速，向微芯片中注入反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)。用電子控溫板控制微芯片的溫度。反應(yīng)流程示意圖見圖2（b）。通過注射泵的“推-拉”進(jìn)行反應(yīng)液在微通道中的循環(huán)反應(yīng)。

圖2 “S”型通道形狀以及反應(yīng)流程Fig.2 S-shape channel and the reaction process

2 結(jié)果與討論

2.1 賴氨酸環(huán)化脫氨酶的催化特性

為研究賴氨酸環(huán)化脫氨酶的催化性質(zhì)，首先在搖管中對影響賴氨酸環(huán)化脫氨酶的催化活力的幾個(gè)重要因素進(jìn)行了研究。影響賴氨酸環(huán)化脫氨酶催化反應(yīng)的主要條件有底物濃度、pH、輔酶NAD+添加和Fe2+等。作者分別對其進(jìn)行了研究，結(jié)果見圖3。其中圖3（a）是不同底物濃度得到的產(chǎn)量曲線，圖3（b）、圖 3（c）和圖 3（d）為不同催化條件下反應(yīng) 72 h后測得的產(chǎn)量。

圖3 賴氨酸環(huán)化脫氨酶的催化特性Fig.3 Characteristic of lysine cyclodeaminase

從圖3（a）可以看出，初始賴氨酸質(zhì)量濃度最佳條件是12 g/L。賴氨酸質(zhì)量濃度過低時(shí)不易得到產(chǎn)物積累，而賴氨酸質(zhì)量濃度太高會(huì)對酶催化產(chǎn)生底物抑制作用。如圖3（b）所示，pH高于6.5時(shí)，能得到產(chǎn)物積累，其中pH為7是最佳催化條件。pH低于6時(shí)由于酶易失活，酶催化不能進(jìn)行。賴氨酸環(huán)化脫氨酶作用時(shí)候會(huì)結(jié)合NAD+作為輔因子。不同于細(xì)胞內(nèi)本身代謝就會(huì)產(chǎn)生游離的NAD+，游離酶所在的體系中需要添加一定的NAD+，作者對此進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)0.3 g/L是最佳NAD+添加量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)體系中加入0.5 g/L的Fe2+會(huì)較多的提升哌啶甲酸產(chǎn)量，而過多的Fe2+會(huì)抑制賴氨酸環(huán)化脫氨酶的活性，見圖 3（c）和圖 3（d）。 因此，LCD 酶催化賴氨酸合成哌啶甲酸的搖管最佳反應(yīng)條件為底物質(zhì)量濃度 12 g/L，初始 pH 為 7，NAD+添加 0.3 g/L，F(xiàn)e2+添加0.5 g/L。反應(yīng)約66 h結(jié)束，L-哌啶甲酸產(chǎn)量達(dá)到2.2 g/L。

2.2 微芯片各條件對于賴氨酸環(huán)化脫氨酶催化速率的影響

2.2.1 微通道尺寸對哌啶甲酸產(chǎn)量的影響 微通道尺寸是影響流體反應(yīng)的一個(gè)重要因素。制作了通道尺寸為 200、300、400、700、1 000 μm 的微芯片，并分別用其進(jìn)行了賴氨酸環(huán)化脫氨酶催化反應(yīng)。催化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間6 h，反應(yīng)液流速40 μL/min，通道長度31.2 cm，數(shù)據(jù)見圖4。

圖4 微通道尺寸對哌啶甲酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of microchannel size on the yield of PA

由于微通道的尺寸直接決定了反應(yīng)液流體的性質(zhì)，因此微通道的尺寸會(huì)對酶的催化速率產(chǎn)生重要的影響。當(dāng)微通道的尺寸縮小到一定程度時(shí)，流體中的界面效應(yīng)會(huì)發(fā)生明顯增大的現(xiàn)象，各組分中的分子由布朗運(yùn)動(dòng)而產(chǎn)生的傳質(zhì)效果也顯著增強(qiáng)，使酶分子與賴氨酸更容易接觸，促進(jìn)催化反應(yīng)的進(jìn)行。從圖4可以發(fā)現(xiàn)，尺寸為1 000 μm的通道內(nèi)酶催化速率慢，當(dāng)微通道尺寸縮小后，催化速率顯著加快。當(dāng)微通道尺寸減小到400 μm以內(nèi)，尺寸效應(yīng)變得不再那么明顯。尺寸200μm的通道內(nèi)的催化速率較300 μm和400 μm的通道稍高一些。反應(yīng)6 h后產(chǎn)量達(dá)到0.20 g/L，比搖管中對照反應(yīng)所得增加了19.9%。

2.2.2 微通道長度對哌啶甲酸產(chǎn)量的影響 微通道的長度是指構(gòu)成通道的幾何圖形的總長度，本次實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的微通道長度通過AutoCAD來進(jìn)行準(zhǔn)確測定，總長為31.2 cm。作者研究了微通道長度對哌啶甲酸產(chǎn)量的影響，利用不同長度的200μm尺寸的PDMS微通道進(jìn)行酶催化反應(yīng)。催化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間6 h，反應(yīng)液流速40 μL/min，產(chǎn)量見圖5。

圖5 微通道長度對哌啶甲酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of microchannel length on the yield of PA

本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4個(gè)微通道長度，分別是31.2、62.4、93.6、124.8 cm， 實(shí)驗(yàn)中使用多個(gè)通道串聯(lián)以增加微通道長度。由圖5可以發(fā)現(xiàn)微通道越長，微通道對于酶的催化反應(yīng)的作用越為明顯。微通道長度決定了反應(yīng)液在微通道里面的滯留時(shí)間，微通道的延長使酶與底物結(jié)合的機(jī)會(huì)變大。由圖5可以得出長度124.8 cm的微通道為最適條件，此條件下催化反應(yīng)進(jìn)行6 h后，得到了0.24 g/L的產(chǎn)物，產(chǎn)量比搖管中的反應(yīng)增加了40.3%。

2.2.3 微芯片中反應(yīng)液流速對哌啶甲酸產(chǎn)量的影響 在微芯片反應(yīng)中，反應(yīng)液流速也是一個(gè)對酶催化效率產(chǎn)生重要影響的條件。在一定尺寸、形狀的容器內(nèi)，流體流速是影響各組分傳質(zhì)速率的最大因素，流速越快，流體間的傳質(zhì)速率也會(huì)越快。在本次實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)液流速還決定了反應(yīng)液循環(huán)反應(yīng)過程中進(jìn)入微通道的次數(shù)。由于PDMS微芯片的耐壓能力有限，因此不能無限制的增加流速，否則會(huì)因?yàn)楦吡魉賻淼倪^高壓力破壞微通道內(nèi)部已鍵合的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微芯片中的流體發(fā)生泄漏的現(xiàn)象。作者研究了微芯片中反應(yīng)液流速對哌啶甲酸產(chǎn)量的影響，進(jìn)行了20～100 μL/min 5個(gè)不同流速下的酶催化反應(yīng)，結(jié)果見圖6。本次實(shí)驗(yàn)使用尺寸200μm的PDMS微芯片 ，反應(yīng)時(shí)間6 h，通道長度31.2 cm。

圖6 反應(yīng)液流速對哌啶甲酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Impact of current speed on the yield of PA

隨著反應(yīng)液流速的增加，酶催化速率明顯提升。流體流速的增加使其中各組分傳質(zhì)更快，酶和底物有更多機(jī)會(huì)結(jié)合?？紤]到PDMS芯片的耐壓能力，本次實(shí)驗(yàn)將最高流速設(shè)置為100 μL/min。當(dāng)流速為100 μL/min時(shí)，反應(yīng)6 h得到的產(chǎn)量是0.24 g/L，比搖管中反應(yīng)得到的產(chǎn)量多42.1%。

2.3 酶在微芯片與搖管中催化效率的對比

經(jīng)過對賴氨酸環(huán)化脫氨酶催化條件和微芯片中反應(yīng)條件的研究，用優(yōu)化后的條件分別在搖管和微芯片中進(jìn)行了酶催化反應(yīng)。本次實(shí)驗(yàn)采用尺寸200μm，長度 124.8 cm 的微通道，用 100 μL/min 的流速進(jìn)行反應(yīng)，每隔6小時(shí)取樣進(jìn)行反應(yīng)物賴氨酸和產(chǎn)物哌啶甲酸質(zhì)量濃度的測定，結(jié)果見圖7。其中4條曲線分別代表各個(gè)時(shí)刻微芯片和搖管中的賴氨酸和哌啶甲酸含量的變化趨勢。

圖7 微芯片和搖管中的反應(yīng)過程Fig.7 Whole reaction in microchip and shaking tube

在微芯片中進(jìn)行的酶催化反應(yīng)，賴氨酸消耗速率和哌啶甲酸生產(chǎn)速率都快于搖管中的反應(yīng)。在反應(yīng)約44 h時(shí)，微芯片中的反應(yīng)到達(dá)平衡狀態(tài)，此時(shí)產(chǎn)物質(zhì)量濃度為2.22 g/L，底物賴氨酸也不再消耗。搖管中進(jìn)行的反應(yīng)在66 h時(shí)達(dá)到平衡，哌啶甲酸的產(chǎn)量為2.22 g/L，與微芯片中酶催化所得的產(chǎn)量一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在微芯片中的酶催化反應(yīng)比搖管提前22 h完成，整體縮短了1/3的反應(yīng)時(shí)間。

3 結(jié)語

作者設(shè)計(jì)了一個(gè)簡單的“S”型微芯片，用自制裝置實(shí)現(xiàn)快速脫氣完成PDMS固化來制作PDMS微芯片，用于加速賴氨酸環(huán)化脫氨酶催化L-賴氨酸產(chǎn)生L-哌啶甲酸。賴氨酸環(huán)化脫氨酶催化速率較慢，作者對pH、溫度及輔因子添加等催化條件進(jìn)行了一定優(yōu)化，并著重于探索如何使用微芯片加速酶的催化。最終使用尺寸為200μm，通道長度為124.8 cm的微芯片，反應(yīng)液流速設(shè)置為100 μL/min，反應(yīng)44 h后達(dá)到平衡。相比搖管中反應(yīng)66 h反應(yīng)平衡，縮短了1/3的反應(yīng)時(shí)間。

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