兩個(gè)可食鵝膏菌的形態(tài)學(xué)及rDNA～I(xiàn)TS測(cè)序鑒定

田慧敏，田博宇

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

鵝膏菌屬(Amanita)隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycotina）、層菌綱(Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、鵝膏菌科(A-manitaceae)，是有毒大型真菌中較特殊、較有價(jià)值的世界廣布性大屬，其物種具有非常豐富的多樣性.全世界已描述且被承認(rèn)的約500種，我國(guó)約80種[1].主要特征為菌蓋初期卵形，后期呈凸透鏡形或平展，菌蓋常有外菌幕碎片殘留，菌褶離生或近離生，白色，菌柄中生，易與菌蓋分離，柄基部常常膨大成球形，菌環(huán)有或無(wú)，菌托環(huán)狀，苞狀或鱗片狀，孢子印白色，孢子橢圓形，近球形，光滑，往往含一大油滴[2].鵝膏菌多與樹(shù)木形成外生菌根，促進(jìn)森林的發(fā)育，該屬也有許多優(yōu)質(zhì)食用菌，如橙蓋鵝膏A.caesarea有雞蛋菌的美名，營(yíng)養(yǎng)豐富，十分鮮美.然而大部分種具有毒性，含鵝膏毒肽、鬼筆毒肽、毒蠅堿，產(chǎn)生神經(jīng)精神型中毒癥狀[3]，還有少數(shù)為劇毒菌，如白毒傘A.verna，號(hào)稱“毀滅天使”.在世界各地每年都有人誤食毒菌而死亡，而大多數(shù)死亡原因是誤食了有毒鵝膏，因此鵝膏菌的準(zhǔn)確鑒定尤為重要.傳統(tǒng)鑒定方法往往受到環(huán)境的影響較大，因此菌物學(xué)家紛紛引入分子生物學(xué)手段對(duì)該屬真菌進(jìn)行物種鑒別，以期結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠[4～9].筆者對(duì)2個(gè)赤峰地區(qū)鵝膏菌標(biāo)本利用形態(tài)學(xué)和ITS片段測(cè)序相結(jié)合的方法進(jìn)行分類鑒定，為鵝膏菌的準(zhǔn)確鑒定提供依據(jù)和方法.

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

供試標(biāo)本CFSZ10041、CFSZ10261由田慧敏等采自赤峰地區(qū)巴林右旗和松山區(qū)，拍攝生境照片后，晾干、編號(hào)，超低溫冷凍處理后存放于赤峰學(xué)院菌物標(biāo)本室（CFSZ）.

1.2 形態(tài)鑒定

鑒定方法采用宏觀特征、顯微結(jié)構(gòu)與化學(xué)試劑反應(yīng)相結(jié)合的方法.宏觀特征子實(shí)體大小用游標(biāo)卡尺測(cè)量新鮮子實(shí)體2-5個(gè)，使用體式顯微鏡觀察菌蓋菌柄附屬物，顏色的判斷主要依據(jù)采集時(shí)拍攝的彩色照片，顯微觀察通常4-5%KOH作浮載劑，測(cè)量擔(dān)孢子30個(gè)、菌絲、擔(dān)子、囊狀細(xì)胞以20個(gè)為限.

1.3 ITS鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取

采用CTAB法：子實(shí)體干品菌蓋部分(含菌褶)用液氮研磨，提取基因組DNA[2]，并使用北京鼎國(guó)公司的DNA純化試劑盒對(duì)提取的DNA 1.3.2 rDNA-ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序.

PCR的擴(kuò)增體系為：PCRcolorlessmix25μL，ITS1(TCCGTAGGTG AACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)引物（20μmol/L）各 1μL，模板 DNA2μL，ddH2O22μL，反應(yīng)總體積為50μL.擴(kuò)增反應(yīng)在德國(guó)eppendorf公司的5331型PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，94℃預(yù)變性3min；95℃變性 40s；58℃退火40s；72℃延伸1min，共34個(gè)循環(huán)；最后于72℃補(bǔ)平5min，終止溫度為4℃.PCR產(chǎn)物純化后委托上海生工生物科技有限公司完成.

1.3.1 ITS序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析

將已測(cè)得的ITS序列利用DNAMAN等處理后提交UNITE網(wǎng)站進(jìn)行檢索，將所得的相似序列轉(zhuǎn)換為FASTA格式，用MEGA5.1軟件中的Alignment程序?qū)π蛄羞M(jìn)行多重對(duì)位排比，并利用Analysis程序采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Kimura2-parameter模式計(jì)算遺傳距離，Bootstrap循環(huán)1000次.

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果CFSZ 10041為淡青灰鵝膏Amanita lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin，CFSZ 10261為杏黃鵝膏Amanita crocea(Quél.)Singer.

2.1.1 淡青灰鵝膏Amanita lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin

菌蓋直徑3.8～5.0cm，半球形或平展，灰白色至淺青灰色，中央色深，被白色，不規(guī)則形狀的菌幕殘片，易脫落，菌蓋邊緣有長(zhǎng)條紋，干后條紋處稍變棕黃色，邊緣撕裂，（圖1～A），菌肉白色，薄，約 1～2mm，無(wú)明顯氣味，菌褶近離生，白色，有短菌褶，菌柄 8.0～11.3cm，粗 0.5～0.7cm，白色，有不明顯的絨毛，干后絨毛變黃色，基部膨大近球形，菌托袋狀或苞狀，分裂成兩瓣或多瓣，白色，具微細(xì)絨毛，有稀疏的黃褐色小疣，地下生，菌環(huán)缺如（圖1～B）.

孢子 （7.2～）10.1～14.4×（6～）8.2～10 （～12.0）μm，[Q=1.00～1.57（～1.85），Q=1.23±0.21]，寬橢圓形或橢圓形，有的近球形，含一大油滴，有小尖，非淀粉質(zhì)（圖1～3）.擔(dān)子33.6～57.6（～67.2）×10.1～14.4μm，無(wú)色，有黃色內(nèi)含物，棒狀，上部膨大，有四個(gè)小梗，基部無(wú)鎖狀聯(lián)合（圖1～4）.褶側(cè)囊狀體無(wú)，菌蓋表皮由菌絲組成，往往頂端膨大，頂端細(xì)胞大小為 50.0～72.0×10.0～21.6μm（圖 1～E）.菌幕由囊狀細(xì)胞和菌絲組成，囊狀細(xì)胞無(wú)色，20～42.4×14.0～18.0μm，無(wú)色薄壁菌絲，分枝，有隔膜，直徑 2.9～4.8μm（圖 1～F）.

研究標(biāo)本：內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗，賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)，東溝蒙古櫟林CFSZ 10041，2013年8月12日，劉鐵志、田慧敏等.

圖1 A.lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

與該種相似的其他灰色菌蓋的鵝膏有A.vaginata、A.malleata和A.fraudolenta，但是A.vaginata菌蓋深灰色，菌托袋狀純白色，有微細(xì)絨毛[10～11]，A.malleata 菌托質(zhì)脆，易碎，A.fraudolenta菌柄具有褐色的線狀覆蓋物.而A.lividopallescens鑒別特點(diǎn)菌蓋有碎片狀菌幕殘留，菌柄基部袋狀有黃褐色小疣，且菌幕由囊狀細(xì)胞和無(wú)色菌絲組成，孢子寬橢圓形至近球形Q=1.00～1.57[12～13].分子鑒定結(jié)果顯示A.beckeri與該種親緣關(guān)系近，但是從形態(tài)學(xué)角度，A.beckeri菌蓋很黏，易剝離，灰棕色或赭褐色，菌蓋菌幕片狀，多，且由菌絲組成，故將該標(biāo)本鑒定為A. lividopallescens，該種為鵝膏亞屬（Subgenera Amanita）灰鵝膏組（Section Vaginatae）主要分布于歐洲橡樹(shù)下，在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，屬中國(guó)新記錄種，記載高溫烹調(diào)后可食用[12].

2.1.3 杏黃鵝膏Amanita crocea(Quél.)Singer

子實(shí)體中等大，菌蓋直徑4.5～6.0cm，平展，濕時(shí)稍粘，橘黃色或杏黃色，中央色深，無(wú)菌幕，邊緣有條紋，菌肉厚，白色，無(wú)特殊氣味.菌褶白色，后變淡黃色，密，不等長(zhǎng).菌柄長(zhǎng) 12.5～17.5cm，粗 0.7～1.3cm，圓柱形，基部稍膨大，白色，中空.無(wú)菌環(huán)，菌托白色，苞片狀（圖 2～A,B）.

孢子 9.6～12（～14.4）μm×（7.2～）8.4～10.0（～11.4）μm，[Q=1.50～2.14，Q=1.76±0.18]，橢圓形，近球形，表面光滑，有小尖，無(wú)色，無(wú)淀粉質(zhì)反應(yīng)（圖2～C）.擔(dān)子36.0～57.6×8.6～10.1μm，短棒狀，中部膨大，（圖 2～D），無(wú)囊狀體，菌蓋表皮由輻射狀排列的菌絲組成，菌絲無(wú)色透明，直徑8.4～14.4μm，有的頂端膨大，膨大細(xì)胞大小為36～50.4×11.5～15μm（圖 2～E），菌柄表皮菌絲無(wú)色，常見(jiàn) H 形，有的菌絲膨大成倒梨形，大小為 25～42×10.5～16μm（圖 2～F）.

研究標(biāo)本：內(nèi)蒙古赤峰市巴林右旗，賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)，榮升景區(qū)，樺林地上散生CFSZ 10261，2013年8月14日，劉鐵志、田慧敏等.

圖2 杏黃鵝膏A.crocea(Quél.)Singer子實(shí)體形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)

該標(biāo)本與A.fulva外形很像，但A.fulva菌蓋具褐色色調(diào)，且有片狀菌幕，而杏黃鵝膏A.crocea菌蓋偏于橘黃色，菌蓋無(wú)菌幕殘留，記載可食[2,11,12].

2.2 ITS序列分析

將4個(gè)標(biāo)本測(cè)得的ITS序列與通過(guò)BLAST檢索比對(duì)從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得32個(gè)與供試鵝膏科具有較高相似度的物種（見(jiàn)表1）

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

以鱗鵝膏組的A.manginiana作為外群，對(duì)CFSZ 10041、CFSZ 10261的ITS序列及相關(guān)序列等36個(gè)ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果聚為三類，分別為鵝膏亞屬（Subg.Amanita）的鵝膏組（Sect.Amanita）、和鞘托鵝膏組（Sect.Vaginatae）和鱗鵝膏組（Sect.Lepidella），CFSZ 10041 和 A.lividopallescens聚在一起，支持率70%，CFSZ 10261與A.crocea聚在一類，支持率86%，都屬于鞘托鵝膏組（Sect.Vaginatae）.

表1 與供試鵝膏屬4個(gè)標(biāo)本rDNA～I(xiàn)TS序列相似的物種

綜合上述，形態(tài)學(xué)鑒定方法和ITS測(cè)序法相結(jié)合，將CFSZ10041鑒定為A.lividopallescens(Gillet)Bigeard&Guillemin,CFSZ10261為杏黃鵝膏A.crocea(Quél.)Singer.

圖3 供試標(biāo)本和其最相似物種的ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

赤峰地區(qū)鵝膏科真菌資源豐富，鑒定方法主要以形態(tài)為主，本研究將傳統(tǒng)形態(tài)鑒定法和rDNA～I(xiàn)TS序列測(cè)序分析法相結(jié)合鑒定兩個(gè)常見(jiàn)鵝膏菌，鑒定結(jié)果相互補(bǔ)充印證，較為準(zhǔn)確、科學(xué)，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)中國(guó)新記錄種，該研究不僅對(duì)于認(rèn)識(shí)我國(guó)東北地區(qū)鵝膏屬的物種多樣性具有較重要的科學(xué)意義.

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