鑭暴露對子代大鼠早期神經(jīng)行為發(fā)育的影響

劉慧穎，李鵬飛，劉艷，奉姝，王家駿，李漫

（沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110034）

稀土元素（rare earth elements，REEs）是廣泛存在于自然界的一組化學(xué)性質(zhì)相近的鑭系元素。我國是稀土資源最多的國家，其儲量、產(chǎn)量和出口量均居世界首位。鑭是輕稀土元素的代表，常被用作REEs的神經(jīng)毒性研究［1-2］。已有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育早期對外界有害物質(zhì)的毒性作用極為敏感［3］，而行為發(fā)育指標(biāo)的測定對于確定環(huán)境污染物的神經(jīng)毒性作用具有重要的實際意義［4］。研究發(fā)現(xiàn)鑭暴露可導(dǎo)致兒童或?qū)嶒瀯游镎J(rèn)知能力下降［2，5］。但關(guān)于鑭暴露對子代大鼠生長發(fā)育和神經(jīng)行為反射影響的研究較少。因此，本研究擬建立生命早期鑭暴露的動物模型，就孕鼠鑭暴露對子代大鼠生理發(fā)育、神經(jīng)行為反射以及空間記憶能力的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 氯化鑭（Lanthanum chloride，LaCl3）分析純（國藥沈陽化學(xué)試劑有限公司）。Morris水迷宮（美國Stoelting公司）。

1.2 實驗動物 選取40只清潔級Wistar大鼠，其中雄性12只，雌性28只，體重（240±10）g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SYXK（遼）-2013-0001。實驗動物室溫度（23±1）℃，相對濕度（50±5）%。動物飼料由沈陽市于洪區(qū)前民動物實驗飼料廠提供。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及染毒方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將雌性大鼠按體重隨機(jī)分為4組：對照組和低、中、高劑量染鑭組，每組7只，雌∶雄大鼠以1∶1比例同籠，次日陰道分泌物鏡檢有精子者記為妊娠0 d，將孕鼠單籠飼養(yǎng)，以自由飲水方式進(jìn)行染鑭。對照組飲用蒸餾水，低、中、高劑量染鑭組分別飲用含有 0.25%、0.50%、1.00%LaCl3蒸餾水溶液，子代大鼠斷乳前通過母乳染毒，斷乳后通過自由飲水連續(xù)染毒1個月結(jié)束。

1.3.2 生理發(fā)育指標(biāo) （1）體重：在子代大鼠出生后第 7、14、21、28、35、42、49天（postnatal day，PND4，7，14，21，28，35，42，49）上午定時稱量并記錄體重。（2）張耳：于PND5開始觀察子代大鼠張耳，直到雙耳廓完全張開并達(dá)到完全直立，計算平均張耳時間。（3）開眼：于PND10開始觀察子代大鼠開眼，直到覆蓋在眼睛上的膜完全消失同時可見裂隙，計算平均開眼時間。（4）門齒萌出：于PND5開始觀察子代大鼠出牙，直至有一顆門齒長出牙床，計算平均門齒萌出時間。（5）長毛：于PND5開始觀察子代大鼠長毛，直至子代大鼠全身被覆白色絨毛，計算平均長毛時間。

1.3.3 神經(jīng)行為反射指標(biāo) 于PND5開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直至全部子代大鼠達(dá)標(biāo)。（1）平面翻正反射實驗：將子代大鼠仰放于粗糙的木板平面上，松手后其能在3 s內(nèi)翻正，且四肢同時著地為達(dá)標(biāo)；（2）負(fù)趨地性反射實驗：在一傾斜25°的底板上將子代大鼠頭朝下擺正，1min內(nèi)子代大鼠調(diào)轉(zhuǎn)頭位180°為達(dá)標(biāo)；（3）懸崖回避實驗：將子代大鼠放在一個20 cm高的臺面的邊緣，1min內(nèi)子代大鼠離開邊緣返回或轉(zhuǎn)身即為達(dá)標(biāo)。計算各組子代大鼠各項指標(biāo)達(dá)標(biāo)的平均天數(shù)。

1.3.4 空間記憶能力檢測 Morris水迷宮實驗：取斷乳后30 d的子代大鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練。水迷宮為直徑150 cm，高60 cm，水深32 cm，水溫（22±2）℃，實驗室溫度保持在24～25℃。加入淀粉使水呈不透明狀態(tài)。將水池分為4個象限，在第二象限中央放置一個圓柱形平臺，平臺頂端置于水面下2.0 cm。實驗的訓(xùn)練時間為5 d，每天訓(xùn)練4次，子代大鼠隨機(jī)從4個不同象限入水，記錄其從入水至爬上平臺的時間，即隱匿平臺逃避潛伏期。爬上平臺后停留20 s；如子代大鼠在60 s內(nèi)沒有找到平臺，則使用木棍引導(dǎo)其至平臺并停留20 s，隱匿平臺逃避潛伏期計為60 s。1周后，經(jīng)訓(xùn)練的子代大鼠在相同環(huán)境下再次被置于水池中，進(jìn)行定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗與訓(xùn)練時一樣，記錄子代大鼠的隱匿平臺逃避潛伏期、游泳距離。定位航行實驗結(jié)束后，間隔10min撤除平臺，進(jìn)行空間探索實驗，觀察并記錄60 s內(nèi)動物在原平臺所在象限穿越目標(biāo)的次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析。進(jìn)一步進(jìn)行2組間的比較，方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Tamhane's T2 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LaCl3對子代大鼠體重增長的影響 與對照組比較，低劑量染鑭組子代大鼠在PND35、PND42、PND49體重顯著降低（P＜0.05）；中劑量染鑭組子代大鼠在 PND28、PND35、PND42、PND49體重顯著低于對照組（P＜0.05），在PND49體重顯著低于低劑量染鑭組（P＜0.05）；高劑量染鑭組子代大鼠在 PND28、PND35、PND42、PND49體重顯著 低 于 對 照 組（P＜0.05），在 PND35、PND42、PND49體重顯著低于低劑量染鑭組（P＜0.05），在PND49體重顯著低于中劑量染鑭組（P＜0.05），見表1。

2.2 LaCl3對子代大鼠生理發(fā)育指標(biāo)的影響 與對照組比較，染鑭組子代大鼠的生理發(fā)育指標(biāo)，包括張耳、開眼、門齒萌出和長毛的時間無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 LaCl3對子代大鼠神經(jīng)行為反射指標(biāo)的影響 中、高劑量染鑭組子代大鼠平面翻正反射的達(dá)標(biāo)時間顯著長于對照組（P＜0.05）；高劑量染鑭組子代大鼠懸崖回避的達(dá)標(biāo)時間顯著長于對照組（P＜0.05）；中劑量染鑭組子代大鼠負(fù)趨地性反射的達(dá)標(biāo)時間顯著長于低劑量染鑭組（P＜0.05），高劑量染鑭組子代大鼠達(dá)標(biāo)時間顯著長于對照組和低劑量染鑭組（P＜0.05），見表3。

表1 各組子代大鼠體重增長情況（±s，g）

表1 各組子代大鼠體重增長情況（±s，g）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與低劑量染鑭組比較，2）P＜0.05；與中劑量染鑭組比較，3）P＜0.05

組別對照組低劑量染鑭組中劑量染鑭組高劑量染鑭組n 8 8 8 8 PND7 17.25±1.04 16.75±1.67 16.63±1.06 16.78±1.34 PND14 25.50±1.60 26.13±1.36 24.63±1.85 24.13±1.89 PND21 37.75±1.67 38.50±2.39 36.00±2.00 35.03±2.20 PND28 61.13±2.48 59.25±2.61 56.38±2.881）57.75±3.911）PND35 95.25±3.92 89.13±4.551）84.25±5.421）79.13±4.291）2）PND42 144.00±7.01 128.63±6.521）117.75±9.431）102.13±10.911）2）PND49 194.13±14.22 169.88±6.881）151.25±8.011）2）136.38±5.501）2）3）

表2 各組子代大鼠生理發(fā)育情況（±s，d）

表2 各組子代大鼠生理發(fā)育情況（±s，d）

組別對照組低劑量染鑭組中劑量染鑭組高劑量染鑭組n8 8 8 8張耳5.13±0.35 5.00±0.00 5.25±0.46 5.13±0.35開眼13.75±0.46 14.00±0.76 14.25±0.89 14.00±0.76門齒萌出9.63±0.74 10.00±0.93 10.13±0.84 10.03±0.82長毛7.00±0.76 7.38±0.52 7.13±0.64 7.50±0.54

表3 各組子代大鼠神經(jīng)行為反射指標(biāo)情況（±s，d）

表3 各組子代大鼠神經(jīng)行為反射指標(biāo)情況（±s，d）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與低劑量染鑭組比較，2）P＜0.05

組別對照組低劑量染鑭組中劑量染鑭組高劑量染鑭組n8 8 8 8平面翻正反射5.25±0.46 5.50±0.54 6.50±0.761）7.75±1.171）2）懸崖回避5.50±0.76 5.88±0.99 6.13±1.47 6.75±1.491）負(fù)趨地性反射6.50±0.93 6.50±0.54 8.00±1.072）8.75±0.891）2）

2.4 LaCl3對子代大鼠空間記憶能力的影響 Morris水迷宮結(jié)果顯示，在定位航行實驗中，各劑量染鑭組子代大鼠的逃避潛伏期和游泳距離均長于對照組，中、高劑量染鑭組子代大鼠的逃避潛伏期和游泳距離均長于低劑量染鑭組，高劑量染鑭組子代大鼠的逃避潛伏期和游泳距離均長于中劑量染鑭組（P＜0.05）；在空間探索實驗中，中、高劑量染鑭組子代大鼠穿越平臺次數(shù)低于對照組，高劑量染鑭組子代大鼠穿越平臺次數(shù)低于低劑量染鑭組（P＜0.05），見表4。

表4 各組子代大鼠在Morris水迷宮實驗中空間記憶成績（±s）

表4 各組子代大鼠在Morris水迷宮實驗中空間記憶成績（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.05；與低劑量染鑭組比較，2）P＜0.05；與中劑量染鑭組比較，3）P＜0.05

組別對照組低劑量染鑭組中劑量染鑭組高劑量染鑭組n 8 8 8 8定位航行實驗逃避潛伏期（s）26.92±7.50 33.52±1.051）41.12±6.371）2）48.53±6.461）2）3）游泳距離（m）5.19±1.31 6.37±0.261）7.65±0.821）2）8.29±0.981）2）3）空間探索實驗穿過平臺的次數(shù)3.88±1.25 2.75±1.49 1.63±1.061）0.88±0.841）2）

3 討論

鑭是一種應(yīng)用廣泛的輕稀土元素，在環(huán)境介質(zhì)和食品中含量較高，能夠通過血腦屏障進(jìn)入腦組織并在其中蓄積。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)居住于稀土礦區(qū)的少年兒童在智商均數(shù)和認(rèn)知能力等方面均較對照區(qū)兒童明顯低下［6］。動物實驗證實，鑭可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降［7-8］。說明鑭具有神經(jīng)毒性，因此鑭暴露的預(yù)防及干預(yù)的研究越來越受到人們的關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)對外源性化學(xué)物質(zhì)的毒性特別敏感。由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，通常采用行為各方面的指標(biāo)綜合評價外源性化學(xué)物質(zhì)的神經(jīng)行為毒性。綜合以往的研究，我們選擇了動物早期的生長發(fā)育水平、神經(jīng)行為反射能力和空間記憶能力來探究鑭對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。本研究結(jié)果顯示，PND28、PND35、PND42、PND49鑭暴露組子代大鼠的體重較對照組明顯下降，說明鑭暴露抑制了子代大鼠體重的增長，這與以往的研究結(jié)果［9］相一致。與對照組相比，鑭暴露組子代大鼠的張耳、開眼、門齒萌出和長毛指標(biāo)無明顯變化，說明通過胎盤和早期乳汁吸收的鑭并不能損害子代大鼠的生理發(fā)育能力。通過平面翻正反射實驗、懸崖回避實驗和負(fù)趨地性反射實驗可以看出，隨著鑭暴露劑量的增加，各組子代大鼠達(dá)標(biāo)時間延長，說明鑭暴露對神經(jīng)反射行為能力有一定的影響。同時，也說明神經(jīng)行為反射指標(biāo)對于神經(jīng)系統(tǒng)的早期損害比較敏感。

Morris水迷宮實驗是神經(jīng)行為學(xué)中最常用的測試方法之一，常被用來評估嚙齒類動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力［10］。Morris水迷宮主要包括定位航行和空間探索實驗。定位航行實驗主要記錄動物尋找隱藏在水面下2 cm平臺所需的時間（逃避潛伏期）和游泳距離，逃避潛伏期及游泳距離越長說明動物的記憶力越差?？臻g探索實驗記錄的是撤去平臺后實驗動物穿越原平臺的次數(shù)，次數(shù)越少動物記憶能力越差。有報道顯示，大鼠攝取40mg/kg LaCl36個月后，在Morris水迷宮實驗中的神經(jīng)行為表現(xiàn)明顯異常［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，在定位航行實驗中，染鑭組子代大鼠的逃避潛伏期和游泳距離顯著長于對照組。在空間探索實驗中，中、高劑量染鑭組子代大鼠穿越平臺次數(shù)顯著低于對照組，表明鑭暴露可顯著損傷子代大鼠的空間記憶能力。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)鑭能延緩子代大鼠的體重增長，影響其神經(jīng)行為反射能力和空間記憶能力，說明鑭具有明顯的神經(jīng)毒性。而鑭是否對機(jī)體的其他系統(tǒng)具有毒性以及其毒性作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步的研究。

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